With little help from biotins..

오늘은 심심하니 (…)

Lau et al., The molecular architecture of human Dicer, Nature Struct Mol Biol 라는 논문을 한번 디벼 보도록 하게씀. 논읽남 돋네

이 논문을 디벼보는 주된 이유라면, ‘결정이 안나와여 으흑흑흑 결정만 나와서 디프렉션하면 자연과학세포에서 서로 어서오세요 고갱님 할건데 안나오거든여? 결정이…으후으으아후읔ㅋㅋ’ 하는 상황에 있는 수많은 구조생물학자들이 어떻게 고해상도 결정구조 없이 구조에 대해서 썰을 풀수있는지에 대한 하나의 예를 보여주기 위함이다.

Dicer란 다 아시다시피 microRNA 생성과정의 중추를 담당하는 효소인데

즉 전사된 이후 Drosha/Pasha microprocessor Complex에 의해서 만들어진 ‘머리핀’ 구조에서 머리핀 대가리(..)를 잘라내는 역할을 하는 일종의 ribonuclease.

다음과 같은 도메인 구조로 되어 있고, 각각의 도메인들은 대충 어떻게 생겼는지에 대한 연구는 어느정도 진행되어 있다.

그러나 문제는 전체 덩어리로써 어떻게 생겨먹었는지 모른다는 게 -.-;;

‘저기여..Dicer 구조 나오지 않았음요? PDB 찾아보니까 이거 있든데’

Crystal Structure of Dicer from Giardia intestinalis
그래서 요런 논문도 이미 2006년에 사이언스에 나오셨다.

그런데 문제는 이것은 원핵생물인 Giardia intestinalis 라는 넘 유래이며.


단백질이 고등동물 버전과 별다른 차이가 없으면 그냥 하나로 퉁쳐…가 되겠지만, 문제는 고등동물의 Dicer와 비교하면 이건 상당한 라이트 버전(..) 이라는 것이다.

모바일버전이면 됐지 데스크탑 버전이 필요하나염

즉 고등동물 Dicer에 있는 Helicase domain은 통째로 팔아먹었고(..) 그외에도 전반적으로 마니 다이어트된 버전.

물론 첨부터 이런 듣보잡(..) 생물 유래의 단백질 가지고 연구를 하고 싶진 않겠지만 어쩔수 있냐는. 단백질 잘 안만들어져여. 단백질이 만들어지는 듯 했더니 결정이 안만들어저여 흐규흐규 하다보니 이런 잡생물 유래의 단백질까지 거슬러 올라가는 것은 막스 퍼루츠 옹 이래 구조생물학의 공통적인 꽁수이고, 이러한 라이트 버전 단백질의 구조가 나온 덕에 상당수의 지식을 축적하기는 했지만 아직도 부족하다. 근데 ‘풀버전’ 단백질의 결정은 안만들어져 어쩌라구. 시망인거? -.-;;;

이럴때 대개 구조생물학자들이 하는 짓거리는 ‘도메인별로 쪼가리내’ (Divide and Conquer라고 하면 멋있어 보이나? Divide되고 Conquer되는 게 단백질인지 실험자 개인인지는 두고보면 알것이고..-.-;;)스킬으로써 이 결과 대개의 중요한 도메인들의 결정구조는 나와 있다. 그러나 정작 큰 덩어리에 대한 정보는 부족한게 현 상황.

이때 많이 차용되는 방법론이 저해상도의 Cryo-Electron Microscope (이하 Cryo-EM) 데이터를 얻어서 대충 덩어리가 어케 생겼나 보구, 거기에 도메인을 껴맞추자는 것. 그래서 정제된 단백질 가지고 EM찍고, 수많은 이미지를 평균내서 대충 요런 모델을 만들었다. (음 나 이엠가이 아니다. 어케 하는지는 이엠가이에게 물어라. 야메프리뷰 돋네)

그래서 알흠다운 저해상도의 Cryo-EM 맵이 강림하셨다. 뭐냐 괴수냐. 근데 어쩌라고. 어디가 어디냐 ㅠ.ㅠ 맨붕

지금 문제는

요런 부속들이 어캐 생겼는지는 안다. 대충 덩어리가 어캐 생겼는지도 알았다. 근데 부속을 저기에 어떻게 끼워맞추냐고오오오오…-.-;;;

‘그까이꺼 대학원생 시킨다 하신 겨수님’저기 손들고 서계세요.

즉 각각의 울퉁불퉁한 덩어리가 어떤 도메인에 해당하는지를 알아야 하는데 그게 안되여. 고해상도 결정구조 가지고 맞추려니까 토나와여…의 상황인데 이 문제를 어떻게 극복할 수 있을까?

이들은 제목에서 보듯이 바이오틴-아비딘 인터렉션을 이용해서 이 문제를 해결했다. 업자라면 바이오틴-아비딘 정도야 잘 알겠지만 그냥 약간의 부연 설명.

나 바이오틴

나 Streptavidine

다 아시듯 biotin-streptavidin 결합은 생체내에서 알려진 결합 중 가장 강력한 순간접착제 수준의 결합으로써 (Kd 10-15nM. 그냥 간단히 한번 붙으면 안떨어져 주거도 안떨어져) 여러가지 응용이 있는데, 요점은 이걸 이용하여 streptavidin 을 원하는 도메인에 붙이고, EM을 찍어서 Streptavidin 덩어리가 어디에 있냐에 따라서 어떤 덩어리가 어떤 도메인이냐를 판단하자는 거다.

근데 단백질에 바이오틴은 어떻게 붙이냐구 -.-;;; 물론 chemical crosslinking 어쩌고 하실 분도 있겠지만 통상적으로 cysteine 을 많이 쓰는데 그럴려면 단백질내의 수십수백개 cysteine 다 바꿔야 함. 퀵체인지는 니가 하나? 그러나 요즘은 저런 구차한 방법 말고 꽤 괜찮은 방법이 나왔는데..

Avitag이라는 시퀀스가 있다. 대충 GLNDIFEAQKIEWHW 뭐 요런 시퀀스인데, 이 시퀀스는 대장균의 biotin ligase 가 매우 좋아하는 시퀀스. 즉 바이오틴을 넣고자 하는 도메인에 요 시퀀스 슥 낑겨놓고, 단백질 정제한 다음 biotin ligase로 반응을 시키거나 아님 biotin ligase (BirA)를 같이 발현하는 대장균에서 단백질을 만들어 내면 저어기 Avitag 시퀀스 내부의 K (FEAQKI)에 바이오틴이 슥 들어간다. 참 쉽죠?

이런 걸로 Quantum Dot 이라는 Probe 를 단백질에 붙여서 실험하는 사람도 있다.이 경우에는 단백질 C말단에 저 Avitag 시퀀스를 넣었다. 철지난 관련도 없는 지논문 깔때기 돋네

여튼, 본 논문에서는 위치를 파악할 도메인에 Avitag 시퀀스를 넣고, 가라 스트렙타아비딘! 바이오틴에 박스원이다 하고 EM 동일하게 함.

그랬더니 나온 그림이..

혹 같은게 바이오틴에 붙은 스트렙타아비딘. 즉 PAZ도메인에 Avitag 붙이고 스트렙타아비딘을 붙이니 음 저 위에 혹 돋네. 아항 저기가 PAZ 도메인인거여? 머 이런식.


이전에 결정구조가 나온 Giardia 에도 있는 PAZ와 플랫폼 도메인, RNase III 도메인의 위치를 스트렙타아비딘 위치로 매핑한 다음 비교해 보니 아아아아 기럭지가 안돼 어떻게..훗 잘라 걍. ㅠ.ㅠ 그래서 Giardia 에서는 PAZ, 플랫폼 도메인, RNase III 가 저렇게 컴팩트하게 붙어있지만 기럭지가 안되므로 걍 잘라다 RNase III 도메인은 아래로 쳐넣었다. 아마 시퀀스 보면 Giardia 꺼는 갭 별로 읍는데 고등생물에는 갭 있어 그러니까 뭔가 저 사이에 있을꺼야 하구서…-.-;;

그 다음엔 N 말단에 있는 Helicase 도메인은 어쩔껴? N-Terminal 도메인을 슥 잘라내고 이걸 또 이엠을 찍었다.
아 Helicase 도메인은 저 아래인가부지? 어쩐지 뭔가 잘라내니 엉덩이가 시렵더라니 조아 그냥 가라 저기로 헬리케이즈 도메인 쪼가리 스트럭쳐야 하고 기존에 쪼가리내서 풀어두었던 이 도메인 결정구조를 넣었다.

아마 못된 리뷰어가 물었겠지. ‘흥 너네 이거 너네것만 이엠찍는과정에서 나온 아티팩트 아냐? 비슷한것도 저렇게 생겼어?’

그래서 초파리 Dicer 도 비슷하게 이엠찍어서 해보니 비스무레한 모양 나오드라.
리뷰어 악플 하나에 포닥 두명과 대학원생 두명 테크니션 한명은 석달 밤을 샙니다

그래서 최종적인 모델과 여기에 기반한 저자들의 ‘썰;은 다음과 같드라. (언제나 논문 제일마지막 피겨는 ‘그러면 좋고 아님 말구 ㅋㅋ’ 임을 명심하자)


헬리케이즈 도메인 쪽에서 더블스트랜드 알엔에이가 슈슈슉 들어와서염..PAZ 도메인에 끝부분 붙고, 중간에 있는 RNase III 도메인이 숭덩숭덩 자릅니다. 참 쉽져?
물론 아래의 모델은 비교적 저해상도의 구조 정보를 가지고 구축된 것이므로 차후에 고해상도 결정구조가 나오면 ‘엥 엉덩이에 붙어있다고 생각한게 머리통에 있네’ 하는 사태가 나올수도 있으나…뭐 그러면 더 좋아염. 자연 논문 꺼리 또 나왔다 ㅋ 할테니.


어차피 지금 모델도 이전 모델과 틀리다. 그러니까 모델은 모델일뿐 레알이 아니다. 모델은 모델 클라우디아 쉬퍼돋네

암튼 말은 참으로 쉽게 썼지만, 저 그지스러운 단백질을 가지고 생 노가다를 해서 논문을 만들어 낸 저자들에게 경의를 표하는 것은 잊지 맙시다. ㅋ 근데 통짜로 결정은 언제만들꺼예염?

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s