형광단백질을 이용한 단백질 기능 조절

Optical Control of Protein Activity by Fluorescent Protein Domains, Zhou et al., Science 2012

오늘 둘러볼 논문은 이거.

세포내에서 특정한 단백질의 기능을 알아보는 제일 좋은 방법은 해당하는 단백질을 ‘꺼보고’ 무슨 일이 생기는지 보는 것이다. 컴터 부품의 기능을 알려면 일단 뽑아봅니다 고갱님 기계가 정지합니다 아 앙되잖아물론 이러한 목적으로  유전자 레벨에서 Gene을 Knockout 한다거나 아니면 발현을 Knockdown 시킨다든가, 아니면 Dominant Negative/Active Mutant를 과발현한다거나 태워먹은 CPU를 꼽아보자구염 여러가지 잡스러운 방법이 있지만, 결국 이런 방법들은 일시적으로 단백질의 기능을 ‘꺼보는’ 것이라기보다는 단백질을 아예 뽑아버리는 것에 비유되는 방법이기 때문에 여러가지 문제점이 있다. 컴퓨터에 달려있는 부품의 기능을 알아보기 위해서 CPU라는 부품을 뽑았더니 부팅이 안되염 엉엉엉 

따라서 원하는 장소시간 에 맞추어서 단백질의 기능을 조절하는 방법이 필요한데, 여기서 가장 적절한 방법으로는 바로 빛을 이용하는 것이다. 즉 빛을 세포의 특정한 부분에 가해서 해당하는 단백질의 기능을 발휘할 수 있도록 해준다면 얼마나 좋을까?

이러한 것을 위해서 빛에 의해서 유전자의 발현을 조절, 혹은 단백질의 기능을 turn on/off 할 수 있는 시스템들은 여러가지가 개발되어 왔으나 여러가지 문제들이 존재한다.

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Lim et al., Nature 2009

Arabidopsis의 광합성관련 단백질의 protein-protein interaction을 이용하여 빛에 따라서 특정 단백질을 특정위치 (위에서는 plasma membrane) 으로 targeting 하는 방법. 단, 이를 위해서는 chromophore인 phycocyanobili (PCB)라는 chemical을 넣어주어야 한다.

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Dolmesch et al., Nature Biotechnology 2009

역시 Arabidopsis 의 광합성계 단백질이 Blue light에 의해서 heterodimerization이 되는 것을 이용해서 유전자 발현을 turn on 시키는 예. 파장이 짧아서 에너지가 강하고 따라서 빛에 의한 phototoxicity가 유발될 수 있다는 건 좀 에러. ㅋ

즉, 기존에 여러가지 시스템이 개발되어 왔지만 저마다 여러가지 단점이 있는 경우가 많았다. 게다가 복수의 유전자를 발현시켜야 한다는 점, 단백질 상호작용을 유도하는 것 뿐이고 단백질의 기능을 실제로 off 하는것은 쉽지않다는 점 등등, 이상은 높고 현실은 그닥 녹록하지 않았다라고나 할까.

그러나 지금 발표된 논문은 기존에 발표된 방법들에 비해서 훨씬 간단한 방법으로 특정한 단백질의 기능을 500nm 파장의 빛으로 조절할 수 있다는 점에서 눈길을 끈다.

그럼 이들이 한 일은 무엇인가?

형광단백질 중에서는 특정 파장의 빛에 반응하여 색이 변하거나 색이 나지 않는 것들이 있다. 이중의 하나가 Dronpa 라는 단백질인데, 이 단백질은 500nm 의 빛에서는 빛이 나지 않으나, 400nm 의 빛을 가하면 빛이 나는 것으로 알려져 있고, fluorophore 자체가 화학적으로 변해서 색이 변하는 것이 아니라 가역적으로 turn on/off를 할 수 있는 것으로 알려져 있다.

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뭐 대개의 형광단백질과 마찬가지로 맥주통이다 ㅋ

이 단백질은 야생형은 tetramer 였으나 mutation을 도입하여 monomer로 만든 것. 소개하려는 논문에서는 이 단백질의 145번째 아미노산을 N으로 바꾼 돌연변이는 정상적인 경우에서는 tetramer로 존재하나 500nm 파장의 빛을 가하면 monomer 로 변하면서 빛을 잃고, 반대로 400nm 파장을 가하면 tetramer 로 변하면서 더 밝게 된다는 것을 발견하였다. (A,B,C)

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그리고 dronpa 도메인을 두개 겹쳐놓고 링커로 연결한 넘의 경우에도 빛에 의해서 dimer가 된다는 것을 확인하였다.

ㅋ 그래 맥주통이 두개 엉긴다 쳐 그게 무슨 대수냐구

이제 이것을 이용해서 이 논문의 본연의 목적을 해보도록 한다. 즉, 두개의 단백질에  Dronpa 도메인을 달고, 빛을 가하면 이 dronpa 도메인의 상호작용에 의해서 두개의 단백질의 상호작용을 유도할 수  있지 않을까? 이를 위해서 먼저 Dronpa 도메인에 membrane에 타겟팅하는 시그널 펩타이드인 CAAX 모티프를 달고, 다른 색깔을 내는 형광단백질인 mNeptue에 Dronpa를 달아보았음. 490nm의 빛을 쪼여주면 -> Dronpa 도메인 엉기는게 해소되고 -> Dronpa 달린 mNeptune은 membrane에서 떨어지게 될것임.

Screen Shot 2012-12-01 at 8.57.10 AM

Dronpa는 membrane localizaiton 시그널이 달려있으니 당연히 멤브레인에 몰려있고, mNeptune은 같이 퓨전된 Dronpa에 의해서 membrane에 로컬라이징 되는 것을 볼 수 있음 (제일 왼쪽 아래패널) 그러다 490nm 을 가하면 Dronpa 의 형광이 꺼지고 (따라서 monomer가 되고) 덩달아 mNeptune은 Dronpa에서 떨어져서 membrane에 몰려있던게 떨어져 나가는 것을 볼 수 있다.

여기서 한발 더 나가서 저자들은 Dronpa가 multimer를 형성하는 것에 의해서 타겟 단백질의 활성을 조절할 수 있지 않을까 하는 착상을 하게 되었다. 이 가설을 입증하기 위해서 사용한 단백질은 GTPase Exchange Factor(GEF)인 DH 도메인과 Protease이고 이것의 활성을 Dronpa에 의해, 즉 ‘어떤 파장의 빛을 가해주냐에 따라서 단백질의 기능을 on off 할수있다’ 를 보여주었다.

일단 GTPase Exchange Factor는 대충 이런거.

Screen Shot 2012-12-01 at 9.04.48 AM

즉 세포내에서 무수한 생명활동의 on/off 스위치로 쓰이는 small GTPase는 붙어있는 게 GTP인지 GTP인지에 따라서 구조가 변하고 타겟 단백질에 붙냐 안붙냐가 결정되는데, GDP 가 붙어있어서 inactive 한 넘의 GDP를 GTP로 갈아넣어서 다시 액티브한 폼으로 바꿔주는게 GEF. ㅇㅋ?

DH-rac

PDB:1FOE

위의 그림에서 파란색이 GTPase (Rac), 하늘색이 GDP 폼의 inactive GTPase 를 GTP 폼으로 바꾸어서 활성화해주는 Rac 얼마까지 알아봤어 싸게 활성화해줄께  GEF 인 DH

그런데 GEF의 앞뒤에 Dronpa를 달면 이게 이렇게 되서 DH에 GTPase인 cdc42가 붙는것을 방해하게 된다.

inhibited

DH : 좋….좋은말 할때 저 걸리적거리는 맥주통 빨리 뻇! 고갱님이 차 못대잖아!

여기에 490nm 파장의 빛을 쬐주면 엉겨있던 Dronpa의 단일화(?)가 결렬되면서 이렇게 GTPase인 cdc42 가 DH 에 결합되서 cdc42를 활성화시켜줄 수 있게 된다.

activated

Dronpa 단일화 결ㅋ렬ㅋ이제 DH 도메인은 다시 활성화 상태

그렇다면 DH도메인이 490nm 파장의 빛에 의해서 활성화되면 어떤 일이 일어나나? cdc42가 활성화되면 세포내의 이동을 촉진하는 메커니즘중의 하나인 filopodia 가 활성화되게 되는데 한마디로 빛을 30초간 쬐주고 30분 정도 기다리면 세포에 이렇게 가시(?)모양의 돌출형태가 생성되게 된다.

Screen Shot 2012-12-01 at 12.56.16 PM

빛받으니 고슴도치 돋넼

또 다른 단백질의 활성을 Dronpa로 조절하는 예로써 든 것은 Protease 활성조절. 역시 Dronpa 를 앞뒤로 달아두어서 Protease 의 활성을 정상상태에서는 막아둔 단백질에 빛을 가해서 단백질 분해효소 활성을 빛으로 조절하는 예이다.

Screen Shot 2012-12-01 at 12.58.39 PM

여튼 본 논문은 Photoactivable Florescence Protein인 Dronpa를 이용하여 단백질 기능을 조절하는 ‘스위치’ 로 활용한 매우 재미있는 예라 하겠다. 물론 Dronpa를 Fusion 시켜서 단백질의 기능을 방해할 수 있는지 없는지는 단백질의 구조에 따라서 틀리고, 어디에 Dronpa를 붙일것인지는 개별적으로 봐야겠지만, 어쨌든 임의의 단백질의 기능을 빛을 통해서 turn on/off 를 시킴으로써 다양한 생명현상을 좌우하는 단백질들에 대한 ‘스위치’ 를 인위적으로 만들 수 있다는 점에서 매우 중요한 논문이라 할 수 있겠다. 물론 형광단백질인 Dronpa를 붙임으로써 Detection 을 쉽게 할 수 있다는 것은 덤 ㅋ

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