오늘의 논읽남 : 칼슘을 칼슘칼슘, 오라이?

오늘 소개할 논문은 아래 논문.

Hou et al., Crystal Structure of the Calcium release-activated Calcium Channel ORAI, Science 2012

오라이? 주차장과 후진주차가 생각나는 이름이지만 주차장은 잊자

세포내에서 칼슘이온은 중요한 신호전달의 매개체, 즉 Second Messanger로 사용된다는 것은 세포생물학 배운 사람이면 다 알고 있을거임. 그런데 칼슘이 세포 내에서 신호전달물질로 사용되기 위해서는 정상적인 조건에서 Cytoplasm의 칼슘 농도는 매우 낮게 유지되어야 함. 그래야만 칼슘 이온의 농도조절에 따라서 신호를 전달할 수 있게 되는것임. 보통 세포 밖의 Ca2+ 농도는 약 1mM 정도를 유지하나 Cytoplasm의 Ca2+ 농도는 100nM 정도로 매우 낮게 유지되고 있음

통상적인 세포에서는 Endoplasmic reticulum 이 Ca2+의 저장소 역할을 함. Ca2+ 농도 를 낮게 유지하기 위해서 Cytoplasm에 존재하는 칼슘을 에너지를 써가면서 ER로 계속 뽐뿌질할 필요가 있으며 이 역할을 하는 단백질이 SERCA 라고 함. 반대로 Inositol Triphosphate (IP3)에 의해서 ER 에 저장된 칼슘이 방출되는 역할은 IP3 receptor Calcium Channel이 수행함
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근데 세포 내에서 칼슘 저장소인 셈인 ER 내의 칼슘이 다 떨어지면 어찌함? 그 경우에는 없는 칼슘은 만들어 낼수도 없고 ㅋ 세포 외부로부터 칼슘을 받아들여야 할것임. 이때 작용하는 단백질이 두가지가 있는데 ORAI 와 STIM임.
ORAI는 plasma membrane에 존재하는 칼슘 채널임. ER내의 칼슘이 떨어지면 ORAI 채널이 열려서 세포 외부로부터 칼슘이 유입됨. 그렇다면 plasma membrane 에 존재하는 ORAI 라는 채널이 ER내의 칼슘이 떨어졌는지는 어떻게 알수 있나? 여기에 관여하는 단백질이 STIM이라는 단백질임. 위의 그림에서 보는 것처럼 STIM은 ER membrane에 존재하는 단백질로써 ER 내의 칼슘 농도를 모니터링함. 만약 ER 내의 칼슘 농도가 충분하면 STIM은 ER membrane 내에 골고루 분포하게 되어 있음. 그러다가 ER 내의 칼슘 농도가 떨어지면 STIM들이 디글디글 한군데로 모이게 되고, 이렇게 모인 STIM은 ORAI와 상호작용하여 ORAI 를 turn on, 즉 저기염. ER에 칼슘 떨어졌거든요? 칼슘 배달 부탁해염. 한다는 것임.
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음. 참 쉽져? ㅋㅋㅋ
 그러나 이런것들을 좀 더 뒤벼보면,
1. ORAI는 어떻게 선별적으로 Ca2+ 를 통과시키나? Na+나 K+가 슥 통과하는 것을 어떻게 막음?
2. ORAI는 정상적인 경우에는 닫혀있다가 STIM과의 인터렉션에 의해서 채널이 열리게 되는데, 이건 실제로 어떻게 이루어지나?
이런 분자수준에서의 메커니즘을 알기 위해서는 당연히 단백질 구조가 필요하나, 문제는 대개의 막단백질의 구조 결정은 지극히 어려운 문제. 새로운 클래스의 막단백질의 구조를 규명하면 ‘중추신경’ CNS 류의 저널에 나가는 것은 그만큼 어렵기 때문. 그렇지만 상당수의 막단백질이 생리적으로 매우 중요한 역할을 수행하며, 또한 중요한 Drug Target 이라는 것을 생각하면 어려워도 해볼만한 가치가 있는 일이라고 할 수 있겠다. 난 안할거지만
그래서 이번에 소개할 논문은 ORAI의 최초 단백질 결정구조가 나왔다는 내용. 당연한 이야기지만 기존에 풀린 적이 없는 새로운 클래스의 막단백질, 게다가 수많은 생명현상에 관여하는 단백질의 경우 당연히 일부 저널에만 편중되어 나온다.
구조를 결정하기 위해서 저자들은 약 50종의 다른 생물유래 ORAI 단백질을 가지고 다양한 컨스트럭트를 만들어서 어떤 것이 결정구조를 풀기 위한 단백질생산 및 결정만들어지는데 유리한지를 테스트하였다. 즉 50종의 컨스트럭트 * 서로 다른 조합의 컨스트럭트를 만들었으므로 적어도 수백개 이상의 컨스트럭트를 만들었다는 이야기 ㅋ
그래서 결국 최종적으로 구조를 푸는데 사용한 컨스트럭트는 Drosophila 유래의 ORAI의 132-341 부분. 여기에 두개의 Conserve 하지 않은 Cysteine Residue는 결정화를 돕기 위해서 mutation 했고 (간혹 단백질간의 Disulfide bond 형성이 결정형성을 방해하는 경우가 있다) 그 외에 M3-M4 루프의 variable region 역시 결정최적화 과정에서 mutation. 물론 이런 것들은 다들 시행착오와 노가다를 통해서 알아낸 것. 뭐 이 바닥이 다 그렇지 ㅋㅋ
그렇게 해서 최종적으로 얻은 크리스털은 3.35A로 디프렉션. 물론 이것을 최적화하기 위해서 아마도 수백, 수천개의 크리스터을 테스트했겠고, 몇십번의 싱크로트론 빔라인 트립을 했겠고 그러나 업자가 아닌 독자님은 그런거 신경 안쓰시고
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구조는 다음 그림과 같이 ORAI 단백질의 헥사머가  가운데 칼슘이 통과하는 pore를 중심으로 분포되어 있는 모습. 실제로 6개의 monomer가 대칭을 이루고 있고 pore는 축에 존재한다고 보면 되겠음.
결국 채널의 구조에서 제일 중요한 것은 pore 일텐데 (결국 채널의 역할이 특정한 물질을 선별적으로 통과시키는 단백질이니) pore의 구조는 다음과 같이 되어 있음.
즉, 세포외부쪽에는 두개의 glutamic acid 가 존재하고 있고, Ca2+ 가 cation이라는 것을 생각하면 당연히 cation이 붙는 입구는 negative 한 charge를 띄는 것을 알수 있음. 이렇게 처음에 glutamic acid 가 Ca2+ 를 영접한 다음에는 pore 는 hydrophobic 한 아미노산으로 닫혀져 있음. 참고로 여기서 풀린 ORAI 채널의 구조는 ‘닫힌 상태’ 즉, STIM과 결합하지 않은 상태임. 즉 STIM과 결합하지 않고 있는 상태의 pore는 valine, Phenylalanine, Leucine 등의 Hydrophobic 한 amino acid 간의 hydrophobic interaction 에 의해서 charge를 띈 Ca2+이 쉽게 통과할 수 없는 상태라는 것을 알 수 있음. 이전의 생화학 연구에 따르면 pore영역내의 Hydrophobic 한 아미노산들을 그렇지 않은 아미노산으로 바꾸면 STIM과의 상호작용과 관계없이 별로 선택성이 없이 이온을 통과시킨다고 함. 즉, 여기서 Hydrophobic 한 아미노산들은 채널이 활성화되지 않았을때 pore를 막아주는 역할을 하는 셈임.
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extracellular 영역에는 negative charge를 띈 glutamate가 존재해서 Ca2+를 영접한다면, 반대로 pore의 intracellular 영역에는 positive charge를 띈 아미노산들이 우루루 몰려 있음. 그럴 수 밖에 없는 것이 ORAI 채널은 extracellular 에서 intracellular로 한방향으로 Ca2+를 통과시키는 채널이고, 반대 방향으로 통과를 시키면 안됨. 이를 위해서는 intracellular 의 pore를 통해서 Ca2+ 가 역으로 흘러가면 안되겠고, 그럴려면 아예 처음부터 Ca2+ 가 붙지도 말도록 positive charge가 있는 것이는 것임 한마디로 말해서 세포내로 들어갈때는 마음대로지만 나갈때는 아니란다. 
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빨간 문으로 들어가서 파란 문으로 나오시면 됩니다. 칼슘 고갱님
실제로 ORAI 채널의 뮤턴트 중에서는 채널의 Ca2+ 통과를 막는 뮤턴트 (이렇게 하여 Immune Cell 의 기능을 마비시키는 Phenotype를 나타냄)  가 있는데 이것은 163번째 라이신이 트립토판으로 바뀐 것임. 이 Mutant 의 구조를 결정한 결과 채널이 두개의 Tryptophan 잔기의 Hydrophobic interaction 에 의해서 턱 막혀있음을 볼 수 있었음.
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트립토판 두개가 크로스~ 채널이 막혔슴다.
뮤테이션이 영 좋지 않은 곳에 일어나서 선생은 이제 칼슘을 통과할 수 없습니다. 내가 고자라니 이게 무슨소리요 박사양반
그렇다면 여기서 살펴본 구조는 닫힌 상태의 ORAI 채널인데, 그렇다면 STIM과의 상호작용을 하면 채널이 어떻게 변화하여 pore가 열리게 되는가가 관건일텐데…
고갱님 그 구조는 아직 나오지 않았습니다. ㅋ 아마 저자들의 모델에 따르면 STIM과의 상호작용에 의해 Pore가 넓어지고 (닫힌 상태에서는 Hydrophobic residue간의 상호작용에 의해서 Ca2+가 잘 통과할 수 없다) 이렇게 해서 STIM에 의해서 ORAI 채널이 활성화되는게 아닐까 ㅋ 하는 이야기. 그렇지만 보다 정확한 분자적인 기작을 알기 위해서는 STIM-ORAI 컴플렉스의 구조를 풀어봐야 한다는 이야기. 아마 지금쯤 열심히 삽질하고 있겠져.ㅋ
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논문 마지막 그림은 언제나 희망사항일뿐 ㅋ

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