RSS를 이용하여 Pubmed 논문 따라가기

가끔 ‘너님은 어떻게 최신 논문이 나왔다는 소식을 그리 빨리 암?’ 이런 질문을 듣는다.그러면 ‘Pubmed 잘 찾아보시지 ㅋ’ 하고 답해준다. ;;;

그러나 사실 이쪽 분야 업자 중에서 Pubmed 찾는거 모르는 사람 있는가? 그러나 매일매일 서로 다른 주제에 대해서 Pubmed 검색을 하는 것은 짜증나는일. 자신이 검색하고 싶은 주제, 혹은 저자에 대해서 논문이 나오면 바로 알려주면 안될까? 사실 이런 기능은 한 10여년 전부터 있었다. 그 당시에는 이메일로 알려주었었지. 그러나 RSS 기능을 이용하면 이런 것을 한눈에 볼 수 있게 된지도 몇 년 되었지만 잘 안쓰는 분들이 많았다.

이전에 구글 리더에서 NCBI RSS를 등록해서 보는 것에 대해서 글을 쓴 적이 있었는데, 구글 리더는 망했고 -.-;; 이 대체품으로 feedly라는 사이트가 성업중이다. 이제 feedly 기준으로 자신이 원하는 키워드 혹은 저자에 대해서 검색을 하여 이것을 RSS 피드로 만들고 feedly 에 등록하여 원하는 키워드에 대한 논문이 뜨자마자 보는 방법을 알아보자.  뭐 아는 사람은 이미 다들 알고 있는 것이겠지만.

1. Pubmed 에 가서 원하는 키워드, 저자이름 등을 검색. 설마 이거 모르는 이 분야 업자분 없겠죠.

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2. 검색 결과가 슥 나오는데 여기서 ‘RSS’ 에 주목

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3. ‘Number of items displayed’ 는 뭐 걍 100개. Feed Name은 뭐 적당히 바꾸든지 하고. 어쨌든 그다음 ‘Create RSS’를 클릭

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4. 그러면 이런 창이 뜨는데 여기서 ‘XML’ 을 클릭

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5. 그러면 뭐 이런게 나오는데 내용은 무시하고 주소를 복사

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6. feedly.com 으로 ㄱㄱ. 가입 안된분은 가입

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7. 상단의 ‘+Add Content’ 를 클릭

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8. +Add Content를 누르고 나오는 란에 5번에서 복사한 주소를 paste

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그러면 아까 생성된 RSS feed가 등록되는데, 이걸 추가하려면 + 클릭.

8. 그러면 카테고리로 어떻게 등록할래 나오는데 뭐 ‘논문’ 정도 카테고리 만들고 여기에서 선택한 다음 추가Image

9. 이렇게 등록해 두고 Feedly 메뉴를 슥 가보면

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9. 해당 항목을 선택하면 안 읽은 feed (즉, 아직 체크하지 않은 논문) 만 슥 나옴.

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10. 이런 과정을 반복하여 자신이 눈여겨 보는 연구자, 주제 등에 대한 목록을 만들어 둠. 그리고 가끔 일주일에 한번 정도 feedly 에 접속하여 체크해 봄. 그래서 새로 논문이 뜨면 그때 체크해 보면 되는것임. 참 쉽져?

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Secret Lab of a Mad Scientist에서 사찰대상이 된 과학자들의 일부ㅋㅋㅋㅋ

개인적으로는 연구주제 키워드를 통해서 검색하는 것보다는 책임저자의 이름 및 소속 (한국사람인 경우에는 Kim S 뭐 이런것만 치면 안되고 소속과 같이 써주는 센스) 을 통해서 검색하는 것이 효율적이었으나 이것은 개인의 취향대로 하시고. 개인사찰이 짱이라니깐요 

그러나 이런 글을 아무리 써봐야 논문책상에 배달해주기 전에는 안보는 사람이 태반인 불편한 진실

“이런 것을 연구해봐야 밥이 나오냐 쌀이 나오냐” 하던 연구의 말로 (후편)

전편 링크

4. 2010. 그래서 미생물도 한번 감기가 걸리면 그 이후에는 잘 안걸리는 건 알겠는데, So what?

미생물의 적응면역이라는 신기한 토픽이 모 럭숴~리 저널에 한번 뜬 이후에 꽤 많은 덕후관련분야 학자, 혹은 꼭 관련분야가 아니었던 학자들의 관심을 끌게 되었다. 주로 이전까지는 미생물을 연구하던 분자생물학자/분자유전학자들이 주로 관심을 가졌다면 이제는 생화학자/구조생물학자 등 개별 단백질의 기능을 연구하는 사람들 역시 이 희한한 현상에 관심을 갖게 되었다고나 할까. 유전학자들이 대충 깨각깨작 그러놓은 그림을 실제 화학반응과 분자구조로 구체화하는 것은 언제나 불쌍한 생화학자와 구조생물학자의 몫. 

어쩄든 요쿠르트 회사의 하라는 연구는 안하고 엉뚱한 연구를 하던 연구자 2은 그동안의 연구결과들을 종합하여 다음과 같은 리뷰를 쓰게 되었다.

1. 파지가 박테리아 안으로 자기 DNA 를 찔러넣어! 왼손으로 DNA를 잘 파지했다 세균안으로 잘 투척~

2. 그러면 박테리아 세포내의 CAS 단백질 컴플렉스가 ‘어딜 감히?” 하고 파지 디엔에이에 척~ 붙어서 슥삭슥삭..

3. 일단 잘라놓은 넘이 나중에 또 들어오면 어쩌지? 지놈안에 붙여놓자. 나의 지놈은 포스트잇20bp 단위로 잘라서 차곡차곡 여태까지 들어오려고 했던 넘들것과 잘 모아두어용. 책갈피로 잘 구분해 두고 (이 책갈피가 바로 CRISPR에 나오는 Repeat)

4. DNA에 들어있는 ‘파지 DNA 조각모음’ 은 RNA 로 카피되고, 이건 잘 잘라서 crRNA라는 조각이 되고, 이것은 cas9 라는 단백질과 붙어서 또 Phage가 들어오는지 잘 감시~

5. 한번 들어왔던 놈이 들어오면 crRNA 와 붙는지 보고, 붙으면 와락~ 하고 잘라버림. 들어갈 땐 마음대로지만 나갈땐 아니란다

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적색으로 된 번호가 위의 설명에 해당하는 스텝.

물론 이러한 그림에 해당하는 단백질들이 어떻게 생겼는지, 어떻게 촉매작용을 수행하는지는 생화학자, 구조생물학자 너님들이 하셈~ 뭐 어쨌든 지금 현재까지도 ‘참 신기한 일이 다 있네~ 근데 왜 이런데 국민의 혈세를 낭비하지? 이런 것을 하면 쌀이 나오냐, 밥이 나오냐…’ 하던 사람이 있었을지도. 그러나 이미 이 시점에서도 내공이 높은 덕후학자들은 이 껀을 좀 뒤비면 뭔가 쩐이 될만한 게 나오리라는 낌새를 채고 있었다.

5. 2012. Programmable Restriction Enzyme

이렇게 요구르트 가이 2명이 던진 떡밥을 문 구조생물학자 중 한명이 버클리에 사는 제니라는 눈화였다. 제니 눈화의 전공이 원래 RNA를 쓱삭쓱삭 자르는 효소들이 어떻게 생겨먹었냐거든. 여러가지 일을 했지만 이전에 한 일은 진핵생물에 있는 어떤 쬐끄만 알엔에이를 짜르는 효소의 구조를 밝힌 것 등등. 어쨌든 저 업계에서는 좀 네임드라고 알아주는 양반이라고 생각하면 된다.

첫번쨰로 한 일은 CRISPR에 코딩되어 있는 바이러스 RNA 쪼가리들이 어떻게 각각 잘라지는지를 본 일.

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CRISPR가 일단 RNA 형태로 전사된 다음, CRISPR와 같이 따라다니는 유전자 중 CSR4 라는 넘이 리핏으로 구분된 스페이서 (파지 DNA 쪼가리) 를 슥슥 자르는데,

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리핏 부위의 stem-loop를 인식해서 자른다는 것을 밝혔다.

다음 스텝은 이렇게 만들어진 crRNA가 어떻게 파지 DNA를 자르느냐인데, 2012년 매우 결정적인 단서가 되는 연구를 스웨덴의 그룹과 공동으로 역시 모 과학 주간지에 발표하였다. 

1. 파지의 DNA 를 자르려면 3가지가 필요하다. 즉 파지 DNA 시퀀스와 동일한 crRNA + 실제 DNA를 자르게 하는 단백질인 cas9 + crRNA 와 cas9을 연결하는 tracrRNA

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2. 이 3가지를 넣으니 시험관 내에서 특정한 DNA를 자를 수 있어! 즉 CRISPR 시스템이 CRISPR에 들어있는 DNA 정보를 RNA로 변환한다음, 이것을 이용하여 파지의 DNA를 자를 수 있다는 것을 입증한 셈이다.

3. crRNA와 tracrRNA를 이어도 DNA가 잘라져! 그 이야기는 단백질인 cas9과 실제로 자를 서열의 DNA에 상응하는 RNA정보인 sgRNA 이 두가지만 있으면 DNA를 자를 수 있는 단백질 + RNA 하이브리드가 생기는 셈이다.

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그런데 여기서 중요한 포인트. 그렇다면 파지 DNA만 잘릴까? 즉 sgRNA에서 target과 상동성이 있는 시퀀스만 바꿔주면 sgRNA의 서열에 상응하는 어떤 DNA 만 자를 수 있다는 것을 확인하였다. 즉 이들은 여기서 RNA 서열만 바꾸어주면 자를 시퀀스를 결정해주는 ‘Programmable Restriction Enzyme’ 을 만든 것이다.

분자생물학에 약간의 지식이 있는 업자분들이라면 이게 무슨 의미인지 아실거다. 기존의 ‘유전자 재조합 기술’ 에 사용되던 제한효소는 대개 6bp, 길어봐야 8bp 정도의 서열을 인식하는 효소였고, 어떤 서열을 인식하는지는 고정되어 있었다. 그러나 이제 약 20bp 정도의 시퀀스를 인지하여 정확하게 자를 수 있게 된 것이다.

‘그게 어쨌다고?’ 생각하는 분들을 위해서 빨리 다음으로 넘어가자. ㅋ

6.2013. 고등생물의 지놈을 사각사각~

사실 유전자 재조합 기술이 나온지는 1970년대이긴 하지만, 이것을 쉽게 비유하자면 수백만 권의 책이 꽂혀있는 도서관에서 책 하나만 어쩌다 대출해서 깨작깨작 낙서해서 다시 꽂아놓는 정도랄까, 즉 지놈 스케일에서 유전자를 마음대로 조작하는 것은 공상과학 소설에서나 나오는 이야기처럼 취급되었다. 그 이유는 앞에서 설명한 것처럼 수억 bp 에 달하는 염색체에서 원하는 부분만을 슥 잘라서 갈아끼는 것이 힘들었기 때문. 기존에 사용되던 제한효소는 대개 6-8bp 정도의 서열을 특이적으로 인식한다. (퀴즈. 그러면 2억 bp에 달하는 염색체를 6bp를 특이적으로 인식하는 제한효소는 몇 조각을 낼 수 있을까?) 한마디로 말해서 이런 무딘 칼을 가지고 정밀하게 지놈을 깨작거리는 것은 그닥 쉬운 일이 아니었다고나 할까.

그러나 약 10년전부터 이런 한계를 극복하고 10 bp 이상을 인식하여 임의의 지놈 영역을 잘라서 붙일 수 있는 방법들을 개발하고자 여러가지 시도가 진행되었다. 첫번째 시도는 Zinc-Finger Nuclease.

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즉 DNA 결합영역으로 유명한 Zinc Finger 모티프에 Nuclease를 달아서 1, 임의의 DNA를 인식시키고, 2. 이를 잘라보려고 하던 시도였다. 그러나 1. 인식가능한 염기가 약 10bp 정도밖에 되지 않아아서 Off-site effect (원하지 않던 부분도 슥슥 잘라버리는) 가 심했고, 2. 특정한 염기를 인식하려면 이를 인식할 수 있도록 복잡한 유전자를 만들어야 하는데, 이 과정이 극히 번거로웠고 3. 결정적으로 효율이 그닥 높지 않았다라는 문제가 있었다.

두번째 시도는 TALEN (Transcription activator-like effector nuclease)

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이것은 식물 병원균 유래의 DNA 결합부위에 Nuclease를 달아서 역시 선택적으로 DNA를 인식하여 잘라보려고 하던 시도였다. (이 블로그에서도 작년에 다룬 적이 있는 이야기. 안됐어 TALEN 너의 전성기는 고작 1년뿐 ㅋ ) 1. ZFN에 비해서 약 15bp 정도를 인식할 수 있게 되었으므로 좀 더 특이성이 강화되었다는 장점이 있었으나 2. 역시 특정한 염기를 인식하려면 아래와 같은 복잡한 유전자를 합성해야 한다는 단점이 있었으므로 3. 역시 효율은 생각만큼 높지 않았다라는 단점이 있었다. (DNA 결합부위는 다르지만 자르는 것은 결국 ZFN과 마찬가지로 FokI Cleavage Domain을 사용)

그런데 이제 나온 CRISPR/Cas의 경우에는 ZFN/TALEN과는 다르다, ZFN/TALEN과는!

1. ZFN이나 TALEN의 경우 특정 염기서열을 인지하려면 수백 아미노산이 되는 (DNA 로는 수천 bp가 되는) 합성 유전자가 필요. 그러나 CRISPR는 고작 100bp 이내의 RNA 서열만 있으면 그만. 그정도는 합성으로 한번에 해결 가능. sgRNA 만 갈아끼우면 얼마든지 새로운 서열을 인지하는 제한효소가 탄생.

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TALEN으로 시퀀스 하나 뜯어고치려면 이정도 길이의 유전자를 새로 만들어야 하는데

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CRISPR/Cas로는 요거면 됩니다. 뭘 선택할래 물어보는게 뻘쭘할 지경.

2. 효율이 더 높다.

한마디로 말해서 ‘더 잘 자른다’ 인데, 어쩌면 당연한 일일지도 모르는게, DNA binding domain에 어거지로 DNA 를 자르는 도메인을 달아놓은 인공효소보다 원래 RNA template를 가지고 DNA를 자를 수 있게 ‘진화’ 된 cas9 쪽이 더 효율적으로 DNA를 자른다는 게 서로 비교를 통해서 판명되었다.

CRISPR/Cas 시스템이 ZFN이나 TALEN에 비해서 강점을 가지고 있다는 것을 눈치깐 기존의 지놈엔지니어링 하던 랩들은 우루루 CRISPR/cas 시스템으로 몰려가기 시작했다. 그래서 2013년 초에 3개의 논문이 동시에 튀어나와 이 시스템으로 실제로 고등동물 유전체를 변형시킬 수 있다는 것을 확인했다.

이들 중 MIT 의 Feng Zhang. 이 친구는 원래 Optogenetics 하던 친구다.

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Cas9과 sgRNA를 셀라인에서 발현해서 특정 위치를 ‘일단 잘랐다’ 가 세포내의 blunt end repair 기작으로 복구된 곳에서는 제대로 복구가 되지 않아서 잘못된 베이스가 튀어나온다는 것을 발견

그리고 이런 데 안낄리가 없는 하버드의 George Church (일명 교회아저씨..돈냄사를 잘 맡으시는 것과 성과의 관계는?) 아저씨 역시 거의 비슷한 내용으로 백투백으로 싸이언스에 논문 투척.

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거의 비슷한 구성. cas9 단백질 + 원하는 시퀀스에 Cas9에 붙는 Guide RNA만 있으면 지놈자르기 가능. 여기서 중요한 것은 약 23bp 정도의 서열 뒤의 제일 끝에는 NCC로 끝나는 서열이 있어야 함 (

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DNA 잘라서 복구하는 활성을 TALEN과 비교..빠이빠이 TALEN,

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잘라붙이기 활성으로 GFP를 지놈안에~

7. 2013. 원스텝에 낙아웃 쥐를 만들어보셈

여기서까지는 체외에서 배양한 셀라인에 대한 이야기다. 그렇지만 과연 살아있는 생물에서도 이렇게 유전체를 변형시킬 수 있는가? 사실 극히 한정된 모델생물 (쥐, 초파리, 제브라피시) 에 국한된 이야기지만, 기존에도 유전체를 변형하는 것은 가능하였다. (GMO 동물 무시하나염?) 그리고 원하는 유전자를 지놈 내에서 지워버리는 (Knockout) 혹은 변형하는 (KnockIn) 기술도 마우스와 같은 것에서는 가능했다.

그러나 기존의 기술은 비록 광범위하게 사용되고는 있었지만 몇 가지 문제가 있었는데

1. 복잡. 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell)에서 유전자 조작을 한 후, 이것을 배반포 상태의 마우스 수정란에 주입하여 키메라 마우스를 만들고, 키메라 마우스에서 생식세포로 전이되는 돌연변이를 가진 새끼를 찾아서 이것을 교배시키고…어쨌든 몇 번의 교배와 스크리닝을 거쳐서 얻을 수 있는 일이라고 생각하면 된다.

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출처 1줄 요약:복잡해.

2. 마우스만 돼. 심지어 ‘래트’ 도 쉽게 되지 않았다. 개,소,말, 돼지..쏘리. 일단 배아줄기세포를 비교적 쉽게 확립할 수 있는 동물이 아니라면 낙아웃/낙인은 쉽지 않은 상태.

3. 여러개의 유전자를 동시에 건드리려면? 각각을 따로따로 뮤테이션한 낙아웃 쥐를 만들고 쥐 1와 쥐 2를 교배해서…여기서 유전자가 3개 이상이 되면 그 시간과 노력은 기하급수적으로 늘어난다.

그러나 2013년에 MIT/화이트헤드의 루돌브 야니쉬와  앞서말한 Feng Zhang은 (알만한 사람이라면 다 아는 사람) 는 CRISPR/Cas 를 이용하여 간단하게 낙아웃/낙인 쥐를 만들 수 있다는 것을 보여주었다.

첫번째

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1. 기존에 knockout mouse 만들던 방법대로 ES Cell에서 Cas9과 sgRNA를 이용하여 4개 유전자를 동시에 낙아웃하여 ES Cell을 배반포에 이식하거나

2. 아니면 마우스의 수정란 (1 Cell Embryo – Zygote) Cas9 과 sgRNA RNA를 Cytoplasm (이전에  형질전환 쥐를 만들때처럼 Pronuclues에 injection을 하는 것이 아님. Cas9 와 sgRNA RNA를 injection하면 Translation 된 Cas9에 sgRNA가 붙어서 핵 안으로 들어감) 에 주입하면 핵 안으로 들어가 DNA을 쓱삭쓱삭~ 그 다음에 배아이식을 통해서 원스텝으로 쥐를 짜잔!

두번째

이번에는 Knock-In이다! 기존에 tissue-specific 한 deletion을 만들려면 특정한 locus에 loxP 사이트를 넣는 작업을 했어야 하는데 이 역시 ES Cell을 거치는 노가다 작업. 그러나 이것도 Cas9과 sgRNA를 zygote에만 주입하면 원스탭으로 끝나염

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게다가 원하는 locus에 정확하게 GFP fusion을 이제 만들어 놓을 수 있다! (Santa Cruz Biotech가 이 뉴스를 싫어합니다)

8. 초파리, 제브라피시, 쌀, 애기장대…

셀라인과 쥐라면 다음은 뭐냐?

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“이런 연구를 하면 밥이 나오냐 쌀이 나오냐” 하셨던 고갱님. ‘낙아웃 쌀’ 이 요기잉네요.

모델생물의 대표라고 할 수 있는 초파리가 빠질 수 없죠. 

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Zebrafish

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누에. 

이게 일년도 안되서 모두 이루어진 일이다. 분명한 것은 ‘쌀이 나오냐 밥이 나오냐’ 식으로 시작된 연구를 해서 결국 ‘쌀’ 이 나왔다는 것이다. 

9. DNA 자르는 것으로 그칠 줄 알았지?

CRISPR/Cas9이 특이적으로 DNA를 자를 수 있다는 특성을 이용해서 ‘DNA는 자르지 않고 지놈 펑션을 연구하는’ 여러가지 트릭들도 나오기 시작하였다.

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DNA를 자르지 못하게 뮤테이션이 들어간 Cas9을 이용하여 Translation을 블락

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이번에는 유전자에 변형을 하지 않은 상태에서 단지 발현이 잘 안되던 유전자를 Activation

일년 새에 하도 많은 어플리케이션이 나와서 쫒아가기가 힘들 지경이다. ;;;

10. Editas Medicine : 지놈 수술?

이렇게 불과 일년만에 폭풍이 몰아치듯 온갖 생물에 걸쳐서 지놈에디팅이 기존에 없었던 높은 효율로 가능하다는 것이 보고되고 여러가지 다른 어플리케이션이 나온 이상 이러한 것이 상업적인 이용이 되지 않을 수가 없었다. 지난 11월말, George Church, Feng Zhang 등 CRISPR/Cas 로 지놈에디팅을 주도한 사람들에 의해서 Startup이 설립되었다. 이름은 Editas Medicine. 초기 자본 4300만불.

사실 차세대시퀀싱 (Next Generation Sequencing) 기술이 보편화되고, 이제 몇천 불이면 개인의 지놈시퀀스를 ‘거의’ 알게 된 시점에 있어서 이 정보를 궁극적으로 활용하는 것은 무엇인가에 대한 회의가 많이 있었다. 가령 이런 기술이 보편화되어 개인당 천불, 아니 백불에 시퀀싱을 할 수 있게 된다고 하자. 그래서 시퀀싱을 했더니

“고갱님 시퀀싱 결과를 보니 BRCA1/BRCA2 등등에 아~주 위험한 뮤테이션이 디글거립니다. 님 암 걸리는 거 기정사실임. 마음의 준비를 단단히 하삼”

….음 그리고 땡?

물론 안젤리카 졸리 눈화처럼 이런 검사결과만을 보고 과감하게 예방적 유방절제술를 받을 쿨하면서도 용감한 여성분들도 어딘가는 있겠지만 대개의 경우는 ‘어쩌라구염?’ 밖에 할 수 없는 게 사실. 그런데 지금은 아니더라도 이제 지놈을 어떻게든 슥삭슥삭할 수 있다면?

사실 이미 수천억개의 다세포 생물로 성장해 버린 성인이야 어쩔 수 없다고손 치더라도, 가령 치명적인 유전자를 물려받을 수도 있는 자식이 ‘세포 하나’ (수정란) 일때 이러한 ‘유전자 수술’ 을 한다면? 분명한 것은 쥐 레벨에서는 지금 이미 이런것들이 가능해졌다라는 것이고, 쥐 수정란에서 되는 것이라면 사람 수정란에서도 기술적으로 크게 어렵지 않게 가능할 수 있다는 것이다. 문제는 ‘성공률’ 의 문제겠지만. 

여기서 조금 더 나아가면 강남 성형외과의 성형수슬을 아예 수정란 단계에서 지놈 레벨에서 해버린다면?

상업적인 것을 떠나서 앞으로 사회적, 윤리적으로 폭발적인 문제가 될 수 있는 판도라의 상자가 열려버린 것은 아닐까?

11. 그러나 시작은 잉여 DNA로부터..

CRISPR/Cas가 불러일으킨 것은 가히 ‘광풍’ 이라고 표현될 만할 일이었다. 즉, 제한효소/PCR 이래에 생물학의 기본적인 연구방식을 또 다시 바꾸어버리는 혁신적인 기술이 나왔다는 것은 그렇다치고, 이 기술이 앞으로 불러올 경제/사회적 파급효과는 지금으로는 상상하기 힘들 것이라고 생각한다.

그러나 여기에 대해서 상상을 펼치는 것은 조금 나중으로 미루어두고, 여기서 이 글을 쓰게 된 동기를 생각하보자. 이게 다 처음의 “junk DNA인지 뭔지 알수없는” 그런 묘한 DNA의 발견으로부터 촉발된 일이라는 것. 중요한 과학적인 발견, 그리고 사회적/경제적 효과를 만드는 발견들 중 상당수는 이렇게 의도치 않은 우연찮은 발견, 누가 보아도 ‘밥이 나올지 쌀이 나올지 모를’ 그런 연구로부터 시작되었다. 이런 것은 비단 CRISPR/Cas 의 예가 최초가 아니다. 사실은 1차 ‘유전공학 광풍’ 을 몰고왔던 1970년대의 제한효소의 발견 역시 그 원류는 하찮은 박테리아와 여기에 기생하는 플라스미드라는 DNA 쪼가리에서 나왔다는 것. 이런 것은 진정으로 경제사회적으로 대박이 터지는 연구의 근간은 처음에는 누가 봐도 절대 돈 될 성 싶지 않은 연구에서 나온다는 예를 다시한번 확인시켜 준다.

그러나 사실 기초과학은 이런 ‘잿밥’ 을 얻기 위해 하는 것일까? 기초과학은 그냥 그저 개인의 호기심을 충족시키기 위해 하는 거다. 그러다가 어쩌다 원치 않은 부수입(?)이 생기면 그걸로 좋은 거고. 파인만 아저씨가 했다고 주장되는 유명한  이야기로 글을 마치고자 한다. 

‘Physics is like sex: sure, it may give some practical results, but that’s not why we do it’. 내일 클마스 이브인 연인 중에서도 실용적인(?) 결과를 내실 분들이 있겠지만 그걸 바라신 건 아니시겠죠

“이런 걸 연구해봐야 밥이 나오냐 쌀이 나오냐” 하던 어떤 연구의 말로 (전편)

0. 잡설

주변에 과학자가 있는 사람이라면 그 사람이 무슨 연구를 하고 있는지 자세히 물어본 적이 있는가? 전문용어 쓰려고 하면 “전문용어 말고, 좀 쉽게 설명해봐” 해 가면서. 그렇게 해서 설명을 들어 봤더니  “저런 거 연구해서 도데체 뭐에 써먹음? 난 또 과학자고 박사래니까 무슨 대단한거 하는 줄 알았구만 ㅋㅋㅋㅋ” 이라고 생각해 본 적은 없는가?

….뭐 솔까말 본 블로그 주인이라도 학회라도 가보면 아무리 동업자 쉴드가 쳐진다고 하더라도 솔직히 저런 거 왜 하는지, 저런 것을 알면 왜 중요한 것인지 잘 이해가 안될 경우가 많은데 일반인이라면 오죽하겠느냐고.

그렇다면 이런 것은 왜 하는가? 솔직히 지금 해봐야 돈이 나오는 것도 아니고 쌀이 나오는 것도 아닌 그런 자기만의 세계에 빠져서 우리의 혈세를 낭비하는 과학자넘들~ 참 나빠요 그쵸?

근데 원래 과학자라는 게 다 그런거다. ㅋ 

과학자는 자기 궁금한 것을 알아보기 위해서 너님들의 혈세를 낭비해 가면서 연구를 하는 게 직업이니까..꼬우세염? 님도 과학자 하셈..

이런 이야기를 듣고 어처구니가 없어서 하실 분들은 이렇게들 이야기하실 것이다. “그래도 뭔가 좀 인류의 미래를 위해서 연구한다고 하면 안돼니? 기상이변, 에너지고갈, 암퇴치, 불로장생, 우주정복, 주색잡기‘ 물론 많은 분들은 이런 명분으로 조금 더 많은 혈세를 타가시긴 하지만 사실 이런 명분에 대한 뾰족한 답은 크게 못 내놓으시는 경우가 많다. 결국 이런 명분은 자기가 궁금한 것을 알아보기 위해서 여러 호갱님들의 주머니를 좀 더 효율적으로 털기 위한 명분이라니까.. 업계의 공공연한 비밀을 대중에게 폭로하는 MadScientist는 자폭하라 

그럼에도 불구하고 과학자가 아닌 너님들은 나님의 궁금증을 해소하기 위해서 세금을 내실 신성한 의무가 있는 거다. 왜? 그게 인류가 진보해 온 방식이다. 원시인 시절 하라는 곰새끼와의 현피는 안뜨고 어디 짱박혀서 돌멩이나 가지고 놀던 잉여 원시인 1인에 의해서 인간은 도구를 발견하게 되어서 곰새끼의 브런치가 될 위기를 면했고, 나뭇조가리나 깨작거리던 또 다른 1인에 의해서 불을 발견하게 되었고 그리고 곰탕을 먹게 되는데..

“그건 그때, 지금 너님들이 하는 것은 밥도 안나오고 쌀도 안나오는 혈세낭비” 라고 하실 분들을 위해서 요즘의 전형적인 “아무리해도 돈나오는 것과는 관계없을 연구들” 몇가지를 소개해보도록 하자.

1. 1987. 어떤 잉여 DNA

1987년.  일본 오사카대학. 새로운 유전자 클로닝하면 좋은 박사학위 논문이 되던 시절에 어떤 연구자 한명이 어떤 유전자를 클로닝하여 논문을 발표했다. 여기서 발견하고자 한 유전자가 뭔지는 그닥 중요하지 않다.

어쨌든 시퀀싱을 해서 원하는 단백질을 코딩하는 ORF를 찾고 나니 음? 뒤에 요상한 시퀀스가 있네~ 라는 사실을 인지하게 되었다.

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stem-loop 같은 구조같기도 하고? 근데 뭐하는 넘인지는 모르겠다 ㅋ 그냥 날로먹는 Fig 하나 벌었다 ㅋㅋㅋㅋ

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그리고 논문에는 뭐 요상한게 있는데 뭔진 모르겠다능~ 뭐 걍 정크 DNA가 요기잉네~ 이라고 쓰고 넘어갔다. 사실 과학자가 잉여스러운 관심을 보이는 게 직업이라고 해도 이런 것은 요상하긴 하지만 뭔지 알도리가 있으니 아무리 잉여스러운 과학자라도 이런게 왜 있냐, 뭔 기능을 하냐를 차마 뒤벼볼 용기는 없었다.

그리고 어느정도 세월이 흘렀다.

2. 2002. 정크 디엔에이가 요기죠기 잉네?

2002년. 1987년에는 유전자 하나 클로닝하여 시퀀싱하면 박사 논문이 될 시절이었지만 이제 2002년 정도가 되면 휴먼 지놈 프로젝트에 의한 기술의 발전으로 박테리아 하나 따위는 몇년 정도 시간이 걸리면 전체 지놈서열이 나오던 시절이 되었다. 수백개의 박테리아 지놈 시퀀스가 쏟아나왔다.

이런 지놈 시퀀스를 여러가지 훑어보던 네덜란드의 한 연구자가 이전에 1987년에 발견된 시퀀스가 사실은 여러가지 세균과 고세균에 존재한다는 사실을 알아냈다. 그래서 이런 논문을 냈다.

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각종의 박테리아에 비슷한 반복서열이 모여서 존재하는 경우가 많드라. 그래서 이런 서열을 “일정간격으로 규칙적으로 모여있는 작은 문회(palindormic repeat) 서열” clustered regularly interspaced short palindromic repeats  라는 진짜 멋대가리없는 이름으로 규정했다.

그런데 이런 잡스러운 시퀀스 근처에 보면 단백질들이 있는데, 각 종의 세균에 보니 비슷한 아미노산 서열을 가지는 비슷한 계열의 단백질들이네?

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근데 뭐하는 단백질인지는 모르겠다. 그렇지만 아까 그 잉여스러운 시퀀스에 관련되어 있는건가부지? 그래서 clustered regularly interspaced short palindromic repeats  에서 cas 라는 이름을 붙였다.

그리고 나서 논문 하나 내고 잊어버렸다. ㅋ 아직도 이게 뭐하는 시퀀스인지는 알지 못하는 상태였다.

3. 2007. 감기에 걸리는 유산균

이제 좀 더 시간이 지나서 이제는 2000년대 중반. 덴마크의 요구르트 회사 DANISCO

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요구르트이든 MSG이든 대량의 미생물을 배양하여 발효를 하는 공정에서 가장 큰 문제는 오염. 오염에는 곰팡이 (fungi), 다른 박테리아 등등 여러종류가 있겠지만 가장 심각한 오염이라고 한다면 박테리오파지 (bacteriophage) 에 의한 오염이다. 본 블로그 주인과 동종 업자라면 박테리오파지가 뭔지 정도는 알겠지만 모르는 분이라면 간단하게 말해서 박테리아에 감염되는 바이러스. 뭐 그런거 있다.

“풋~ 박테리오파지는 1950-60년대에 다 연구된거잖아염 저런 시덥잖은 거 가지고 고민하는 님들 좀 한심”이라고 생각하는 양반들도 있겠지만 뭐 그때 연구된 것은 주로 E.coli에 감염되는 coliphage. 그것도 막스 델뷰릭이라는 전직물리학자출신 아저씨가 ‘뭐 우리 여러가지 각자가지고 싸우는데, 그러지 말고 한 서너가지만 가지고 드립다 팝시다‘ 하고 선정된 몇 가지의 박테리오파지. 즉 유산균 등의 산업미생물에 기상하는 파지에 대해서는 아직도 잘 모른다.

여튼 여기는 요구르트 회사이고, 요구르트 발효 도중에 한번 감염되면 컬춰를 완전히 망치는 유산균 박테리오파지에 대한 연구를 조금 진행하고 있었고, 이러한 박테리오파지에 내성이 있는 유산균을 개발할 수 없을까 하고 연구를 하고 있었다. 그런데 재미있는 현상이 발견되었다. 

a 산업적으로 표준처럼 사용되는 유산균이 하나 있었다.

b 여기에 분리한 박테리오파지를 감염하니 당연히 대부분의 균이 싸그리~ 죽었는데, 이 와중에 살아서 콜로니를 형성하는 넘들이 있어!

c 뭐 대개의 사람이라면 여기서 ‘훗 컨탐된겨?’ 하고 버렸겠지. 근데 이 연구자는 이걸 그냥 컬춰해 봤음. 음 컨탐 아니고 유산균 맞음.

f. 근데 여기에 다시 박테리오파지를 감염시켜 봤음. 이젠 안죽어!

오오 이제 박테리오파지에 내성이 있는 유산균 만든 것임? 근데 유산균에 감염되는 파지는 여러가지가 있었음. 그래서 다른 종류의 파지를 감염시켜보니까 캑~ 뭐야. 이러면 쓸모가 없잖아…

뭐 웬만한 산업계의 R&D라면 여기서 그만두었겠지만, 그 연구자가 좀 잉여기질이 있었는지 아니면 회사가 좀 널럴했는지 왜 이런 현상 (사람이 수두바이러스에 한번 감염되면 내성이 생기는 것처럼 유산균도 파지에 한번 걸렸다가 살아남으면 내성이 생기는) 이 일어나는지를 좀 뒤벼보기로 했다. 그래서 논문서치신공.

그런데 찾아보니 대충 이런 논문들이 나왔다. 

CRISPR라는 이름의 세균에 많이 있는 요상한 반복서열이 있는데 이런 것은 파지나 플라스미드의 서열과 비슷하다

그래서 혹시 이런게 파지에 대한 면역현상과 관련있는지 실험을 시작했다.

1. 우리 유산균에도 비슷한 CRISPR 시퀀스가 있어!

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2. CRISPR의 repeat 사이에 있는 시퀀스가 파지의 시퀀스와 비슷해!

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3. 특정 파지에 저항성이 있는 유산균에는 해당 파지의 시퀀스가 CRISPR 안에 존재해!

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4. CRISPR 옆에 있는 cas 유전자를 deletion 하니 면역이 사라져! 즉 이 유전자들은 파지에 대한 면역에 관여하는 것일꺼야..

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즉 결론적으로,

1. 유산균에 박테리오파지를 감염시키면 해당 파지에 대한 면역성이 생길수가 있는데

2. CRISPR라는 정체불명의 유전자 쪼가리들은 특정한 파지에 대한 면역성을 주기 위해서 파지의 DNA 쪼가리를 잘라서 자기 지놈상에 기억해 놓은 흔적이며,

3. 이렇게 지놈내에 ‘기억’ 된  파지에 대한 내성은 cas 유전자들이 부여한다.  

물론 이 시점까지는 어떻게 내성이 부여되는지에 대한 것은 연구가 안된 상태.

물론 아직도 “이걸 하면 돈이 나와 밥이 나와” 의 연구지만 과학적으로는 큰 의미가 있는 연구가 되었다. 즉 기존에 고등동물에만 존재한다고 생각되는 적응성 면역 (Adaptive Immunity – 뭐 쉽게 말해서 항원항체반응) 이 박테리아와 박테리오파지에서도 성립한다는 것은 나름 획기적인 결과. 그래서 논문이 ‘과학’ 이라는 주간지에 실리게 되었다. 

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싸이언스를 정ㅋ벅ㅋ 한 요구르트 회사의 연구진

이제 이십년 전에 박테리아 유전자 근처에서 발견되었던 희한한 시퀀스 하나는 많은 과학자들의 관심을 끌게 되는 유전자가 되었다. 물론 여전히 ‘박테리아도 면역이 있네~ 세상에 희한한 일도’ 수준의 관심이랄까. 관련분야 덕후 학자들의 입장으로는 매우 흥분되는 일이었지만 일반인이나 (요구르트 업계를 제외한) 산업계, 매스미디어가 크게 관심을 끌 일은 아니었다. 

그러나 이들 대다수, 심지어 해당 연구를 수행한 연구자들도 앞으로 몇년 후에 벌어질 일에 대해서는 예상하지 못한 상태였다.

To be continued…

오늘의 논읽남 : Genome Analysis of Single Oocyte

오늘 소개할 논문은 아래와 같은 논문.

Genome Analysis of Single Oocyte

결혼연령 증가로 인하여 출산연령도 증가됨에 따라서 임신에 문제가 생겨서 불임클리닉을 찾는 사람들의 숫자가 늘어나고 있고, 체외수정 (In vitro fertillization, IVF, aka 시험관아기) 로 태어나는 애의 비율이 증가하고 있음.

그런데 노산의 위험 중의 하나는 기형아 출생의 빈도도 증가한다는 것인데, 기형아 출생의 상당수가 난자의 감수분열이 제대로 일어나지 않아서 정상보다 더 많은 염색체를 가지게 되는 현상 – aneuploidy – 라고 함에서 일어남. 그렇다면 이런 것을 예방할 수 있는 방법은 없을까?

…..스무살 이전에 시집장개를 가면 되져 

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출처 35세가 넘으면 급격히 임신의 성공률이 떨어지게 되는데 그 이유는 대개 난자의 퀄리티가 낮아지기 때문임. (젊은사람의 난자를 받으면 안 떨어진다는 것을 생각하면)

결국 이런 것을 예방하는 근본적인 방법은 IVF를 하는과정에서 어떤 난자를 선별하느냐가 중요한데, 문제는 눈으로 보는것만으로는 aneuploidy를 예방하기는 힘들다는것임. 결국은 Genetic Diagnostic이 필요한데, Karyotyping이건 PCR이건 Microarray이건 NGS건 이런것을 하려면 결국 난자를 파괴해서 DNA를 뽑아야 하는데 그러면 IVF에 쓸 난자가 없다는ㅋㅋㅋㅋ

그래서 기존의 방법은 일단 IVF를 하고 좀 키워서 다세포 상태가 된 상황에서 세포 한두개를 떼서 분석하는것인데 (착상전진단 = Pre-implementation genetic diagnosis) 이것도 이미 만들어진 배아에서 미세조작술로 세포 한두개를 빼내는것이라 과정중에서 배아가 손상될 수도 있고 등..

그런데 본 논문은 난자 말고 감수분열시에 방출되는 극체 (Polar Body) 에 있는 염색체를 분석하여 난자가 제대로 된 넘인지를 검사하는 획기적이라면 획기적인 방법임. 제 1극체(First Polar Body)는 diploid 가 완전히 들어있고, 제 2극체(Second Polar Body)는 haploid가 들어있는데,

이걸 분리한후 싱글셀 시퀀싱. 이전에는 효율적으로 싱글셀 유래의 DNA를 증폭할 수 있는 방법이 없었는데 이제는 됩니다. 그래서 First Polar Body에는 투카피, 그리고 Second Polar Body에는 원카피로 들어있는지를 판단하여 aneupoidy 판별..그리고 엄마가 heterozygote 로 안좋은 돌연변이를 가지고 있다든지 하는 경우에 돌연변이 없는 카피를 가진 난자를 IVF에 사용할 수 있다라는 이야기..

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수정란에서 잉여~ 인 Polar body 를 미세조작기로 떼네서 싱글셀 amplification 하고 시퀀싱 ㄱㄱ

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Polar body의 crossover 정보를 이용하여 개인지놈의 Phasing을 완ㅋ료ㅋ

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Polar body의 정보를 이용하여 난자의 Female Pronucleus (실제 자식에게 물려줄 유전정보) 를 예ㅋ측

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제1극체, 제2극체의 카피넘버를 통해서 난자내의 카피넘버 예측 ㅋ

뭐 결과만으로는 많이 어썸~ 해 보이지만 아직 해결해야 할 부분이 많이 남아있다. 

1. 결국 요체가 좋은난자 고르는건데 그렇다면 여러개를 시퀀싱해야 할텐데, 몇개나? 한 20개 한다치고 그러면 20개 * 휴먼지놈 시퀀싱 비용 ㄷㄷㄷ 물론 시퀀싱 가격은 앞으로도 좀 더 내려가겠지만..

2. 수정전의 난자에서 Polar body 뗀후 시퀀싱 결과 나오는게 적어도 하루이틀 안에 되어야 할텐데, 그렇지 않으면 그때까지 난자 동결해두어야 하나..정자와는 달리 난자 동결은 기술적으로 쉽지많은 않음. 시퀀싱 결과 잘 나온 놈 골랐는데 동결해동시 문제가 있다면…

오늘의 논읽남 : 본드칠로 결합구조를

오늘 소개할 논문은 다음 논문이 되겠음.

Genetically Encoded Chemical Probes in Cells Reveal the Binding Path of Urocortin-I to CRF Class B GPCR, Cell, 2013

GPCR의 허구많은 리간드 중에는 당연히 펩타이드들도 있고, 이러한 펩타이드이 어떻게 GPCR에 결합하여 시그널을 전달하는지에 대해서 궁금하신 분들은 참 많음. 그렇다면 이 펩타이들이 GPCR에 어떻게 붙는지 구조를 알면 이런 펩타이드들과의 결합을 억제 혹은 촉진시키는 ‘뭔가’ 도 만들 수 있고, 참 좋은데 문제는 GPCR의 결합구조, 아니 GPCR을 떠나서 막단백질의 결정구조라는게 뭐 그리 쉽게 나와야 말이지…그럼 구조나올 때까지 손가락만 빨던지

이러한 것을 극복하기 위해서 어쨌든 어느정도 바인딩이 어떻게 일어나는지 알아보는 방법으로는 펩타이드 리간드를 합성할때 photoactivation 될수있는 아미노산을 삽입하여 단백질에 결합시기고 UV를 쬐어보고 GPCR과 펩타이드가 어디에서 결합하는지 알아보는 것. 그러나 문제점이 있는데, (1) 펩타이드 여기저기 바꾸니 어피니티가 떨어지는 경우가 많아서 펩타이드를 바꿀 수 있는 위치가 한정되어 있음 (2) 정작 중요한 seven membrane helix부분과의 결합정보를 알 수 없었음.

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그런데 이 논문에서는 반대로 단백질에 Photoactivation 될수있는 아미노산을 삽입하고 네이티브 펩타이드를 붙여봤음. 단백질에 Photoactivation 될 수 있는 아미노산 (즉 20종류의 아미노산이 아닌 특수한 종류의 아미노산) 은 어떻게 삽입하냐고..

이런 부분에 대해서 잘 모르는 분들은 생소할런지 모르겠지만 Scripps Institute에 있는 Peter Schultz라는 아저씨 (현 논문의 책임저자는 Schultz 랩에서 포닥을 한 사람) 는 약 십여년전부터 유전암호를 확장하는 방법에 대해서 연구하고 있었음. 즉 기본적인 개념은 Stop Codon을 인지하는 Suppressor tRNA를 만들고, 이 tRNA에 특이적으로 Unnatural Amino Acid를 달아주는 아미노아실 tRNA synthetase를 만들고 이들을 발현하여 원하는 위치에 Unnatural amino acid를 넣어주는 것임.

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즉 필요한 것은, 1. 스탑코돈을 인지하는 Supressor tRNA  2. 해당 suppressor tRNA에 UAA를 달아주는 아미노아실 tRNA synthetase 3. UAA가 들어갈 코돈에 스탑코돈이 들어간 돌연변이 유전자 이 3가지를 동시에 발현해 주면 됩니다. 참 쉽죠?

….물론 이런것이 어느정도 자유롭게 되기까지는 약 10년 이상의 노력이 걸렸다. 

어쨌든 이미 UV crosslinking이 되는 아미노산을 자유롭게 넣을 수 있는 기술은 한 10몇 년 전에 개발되었다. 이것의 효율을 높여서 이제 진핵세포에 적용할 수 있도록 시스템을 가다듬었다.

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그래서 이 두가지 플라스미드를 HEK293T에 트랜스펙션한 다음 펩타이드 치고 UV를 짠~ 그러니 예상대로 리셉터에 펩타이드가 철퍼덕~ 크로스링킹되었다.

그렇게 해서 무려 150곳을 하나씩 뮤테이션해서 바꿔보고 (QuikChange 하다가 숨졌을지도 모르는 대학원생 or 테크니션 or 포닥에게 애도를 ㅋ) 어디를 바꾸면 어디가 붙나를 조사했음.

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그래서 이러한 결합데이터를 이용하여 펩타이드가 붙는 위치를 정리하고 이것을 이전에 풀린 리셉터 구조에 매핑

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그런데 이 정보만으로는 단백질의 어떤 부분에 펩타이드가 붙는지는 알 수 있지만, 펩타이드의 어떤 부분이 어디에 붙는지는 알 수 없다. 좀 더 특이적인 결합을 알기 위해서 또 역시 다른 종류의 UAA 시스템을 사용하였다.

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이를 위해서 이번에는 Cysteine에만 특이적으로 반응하여 결합을 만드는 Modification을 넣고, 펩타이드의 위치 중 일부를 Cysteine으로 바꾸어가면서 어떤 넘이 어디에 붙는지를 매핑하기 시작하였다. 이렇게 하면 7개의 transmembrane helix의 어디가 어떤 펩타이드에 결합하는지를 알게 된다.

이런 정보들을 종합하여 얻은 모델

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즉, 구조는 나와있지만 복합체와의 구조를 얻기가 힘든 경우는 이렇게 systematic한 mutagenesis와 UAA incorporation에 의해서 대략적인 매핑을 할 수 있다는 이야기임.

한 십몇년 전에 대학원 시절 피터 슐츠가 Unnatural Amino Acid 를 넣는 시도를 하기 위해서  인공 서프레서 tRNA 로 스탑코돈 서프레싱 된다 (그 당시는 아직 단백질에 UAA를 넣지도 못했었음) 이런 논문을 세미나에서 발표하니까 “이거 뭥미 뭐에 써먹어..유전암호를 확장한댘ㅋㅋㅋ쳐돈듯” 식의 반응이 나왔었는데 이런 기술들이 십몇년 묵히니까 이제 진핵세포에서도 이렇게 쓸만할 정도로 발전…

결국 뭔가 쓸만한 기술을 만들려면 일단 하나를 가지고 한 십몇년은 파야 한다는 것을 실감할 수 있었음.