오늘의 논읽남 : 본드칠로 결합구조를

오늘 소개할 논문은 다음 논문이 되겠음.

Genetically Encoded Chemical Probes in Cells Reveal the Binding Path of Urocortin-I to CRF Class B GPCR, Cell, 2013

GPCR의 허구많은 리간드 중에는 당연히 펩타이드들도 있고, 이러한 펩타이드이 어떻게 GPCR에 결합하여 시그널을 전달하는지에 대해서 궁금하신 분들은 참 많음. 그렇다면 이 펩타이들이 GPCR에 어떻게 붙는지 구조를 알면 이런 펩타이드들과의 결합을 억제 혹은 촉진시키는 ‘뭔가’ 도 만들 수 있고, 참 좋은데 문제는 GPCR의 결합구조, 아니 GPCR을 떠나서 막단백질의 결정구조라는게 뭐 그리 쉽게 나와야 말이지…그럼 구조나올 때까지 손가락만 빨던지

이러한 것을 극복하기 위해서 어쨌든 어느정도 바인딩이 어떻게 일어나는지 알아보는 방법으로는 펩타이드 리간드를 합성할때 photoactivation 될수있는 아미노산을 삽입하여 단백질에 결합시기고 UV를 쬐어보고 GPCR과 펩타이드가 어디에서 결합하는지 알아보는 것. 그러나 문제점이 있는데, (1) 펩타이드 여기저기 바꾸니 어피니티가 떨어지는 경우가 많아서 펩타이드를 바꿀 수 있는 위치가 한정되어 있음 (2) 정작 중요한 seven membrane helix부분과의 결합정보를 알 수 없었음.

Screen Shot 2013-12-07 at 5.32.27 PM

그런데 이 논문에서는 반대로 단백질에 Photoactivation 될수있는 아미노산을 삽입하고 네이티브 펩타이드를 붙여봤음. 단백질에 Photoactivation 될 수 있는 아미노산 (즉 20종류의 아미노산이 아닌 특수한 종류의 아미노산) 은 어떻게 삽입하냐고..

이런 부분에 대해서 잘 모르는 분들은 생소할런지 모르겠지만 Scripps Institute에 있는 Peter Schultz라는 아저씨 (현 논문의 책임저자는 Schultz 랩에서 포닥을 한 사람) 는 약 십여년전부터 유전암호를 확장하는 방법에 대해서 연구하고 있었음. 즉 기본적인 개념은 Stop Codon을 인지하는 Suppressor tRNA를 만들고, 이 tRNA에 특이적으로 Unnatural Amino Acid를 달아주는 아미노아실 tRNA synthetase를 만들고 이들을 발현하여 원하는 위치에 Unnatural amino acid를 넣어주는 것임.

Screen Shot 2013-12-07 at 5.36.20 PM

즉 필요한 것은, 1. 스탑코돈을 인지하는 Supressor tRNA  2. 해당 suppressor tRNA에 UAA를 달아주는 아미노아실 tRNA synthetase 3. UAA가 들어갈 코돈에 스탑코돈이 들어간 돌연변이 유전자 이 3가지를 동시에 발현해 주면 됩니다. 참 쉽죠?

….물론 이런것이 어느정도 자유롭게 되기까지는 약 10년 이상의 노력이 걸렸다. 

어쨌든 이미 UV crosslinking이 되는 아미노산을 자유롭게 넣을 수 있는 기술은 한 10몇 년 전에 개발되었다. 이것의 효율을 높여서 이제 진핵세포에 적용할 수 있도록 시스템을 가다듬었다.

Screen Shot 2013-12-07 at 5.44.43 PM

Screen Shot 2013-12-07 at 5.45.22 PM

그래서 이 두가지 플라스미드를 HEK293T에 트랜스펙션한 다음 펩타이드 치고 UV를 짠~ 그러니 예상대로 리셉터에 펩타이드가 철퍼덕~ 크로스링킹되었다.

그렇게 해서 무려 150곳을 하나씩 뮤테이션해서 바꿔보고 (QuikChange 하다가 숨졌을지도 모르는 대학원생 or 테크니션 or 포닥에게 애도를 ㅋ) 어디를 바꾸면 어디가 붙나를 조사했음.

Screen Shot 2013-12-07 at 5.53.55 PM

그래서 이러한 결합데이터를 이용하여 펩타이드가 붙는 위치를 정리하고 이것을 이전에 풀린 리셉터 구조에 매핑

Screen Shot 2013-12-07 at 5.55.28 PM

그런데 이 정보만으로는 단백질의 어떤 부분에 펩타이드가 붙는지는 알 수 있지만, 펩타이드의 어떤 부분이 어디에 붙는지는 알 수 없다. 좀 더 특이적인 결합을 알기 위해서 또 역시 다른 종류의 UAA 시스템을 사용하였다.

Screen Shot 2013-12-07 at 5.57.22 PM

이를 위해서 이번에는 Cysteine에만 특이적으로 반응하여 결합을 만드는 Modification을 넣고, 펩타이드의 위치 중 일부를 Cysteine으로 바꾸어가면서 어떤 넘이 어디에 붙는지를 매핑하기 시작하였다. 이렇게 하면 7개의 transmembrane helix의 어디가 어떤 펩타이드에 결합하는지를 알게 된다.

이런 정보들을 종합하여 얻은 모델

Screen Shot 2013-12-07 at 6.01.26 PM

즉, 구조는 나와있지만 복합체와의 구조를 얻기가 힘든 경우는 이렇게 systematic한 mutagenesis와 UAA incorporation에 의해서 대략적인 매핑을 할 수 있다는 이야기임.

한 십몇년 전에 대학원 시절 피터 슐츠가 Unnatural Amino Acid 를 넣는 시도를 하기 위해서  인공 서프레서 tRNA 로 스탑코돈 서프레싱 된다 (그 당시는 아직 단백질에 UAA를 넣지도 못했었음) 이런 논문을 세미나에서 발표하니까 “이거 뭥미 뭐에 써먹어..유전암호를 확장한댘ㅋㅋㅋ쳐돈듯” 식의 반응이 나왔었는데 이런 기술들이 십몇년 묵히니까 이제 진핵세포에서도 이렇게 쓸만할 정도로 발전…

결국 뭔가 쓸만한 기술을 만들려면 일단 하나를 가지고 한 십몇년은 파야 한다는 것을 실감할 수 있었음.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s