벡터 깎던 노인의 신무기

벡터 깎던 노인

분자생물학, 아니 현대의 실험생물학을 하다 보면 DNA 잘라붙이기 놀이를 하는 것은 피할 수 없는 일. 소위 컨스트럭트 만들기는 1970-80년대에 처음 재조합 DNA 기술이 개발되었을때 ‘유전공학’ 이라고 불리던 아우라는 이제 없지만 (언제 아우라가 있었냐 ㅋ 하시는 분들도 있었겠지만 1980년대에는 논문의 주요 그림으로 사용된 재조합 벡터를 어떻게 만들었는지 구성이 나오곤 했다) 어쨌든 현대의 생물학 연구를 하는데 피할 수 없는 일이라고 쓰고 노가다라고 읽지이 바로 재조합 플라스미드 만들기이다

그러나 한가지 놀라운 것은 대개의 연구자들이 재조합 플라스미드를 만드는 과정은 1980년대 혹은 1990년대에 PCR이 일반화된 이후 그닥 바뀐 것이 없다는 것이다.

즉,

1. 원하는 영역의 DNA fragment 를 제한효소 절단 혹은 PCR을 통하여 증폭해낸다. PCR을 하는 경우 원하는 벡터에 존재하는 제한효소를 Primer 를 이용하여 넣는다
2. PCR 산물을 정제
3. 제한효소로 절단
4. 다시 잘린 넘을 정제
5. 동일한 제한효소로 절단한 벡터와 T4 DNA Ligase로 라이게이션
6. 형질전환
7. 콜로니가 나오면 플라스미드를 뽑든 콜로니 PCR을 하든 제대로 된 넘을 확인

만약 하나 이상의 산물을 넣어야 한다면

7. 또 다른 fragment 를 증폭, 절단
8. 6 과정에서 얻은 벡터를 잘라서 다시 넣기
9. Ligation, 형질전환, 스크리닝…

“끓을 만큼 끓어야 벡터가 되지, 생 dNTP가 재촉한다고 벡터가 되나.”

그렇다면 만약 조합해야 할 조가리의 숫자가 늘어나면 늘어날수록 이러한 식의 전통적인 서브클로닝 방법은 한계를 노출하는데

(1) 가끔은 사용하고자 하는 제한효소 인식부위가 내부에 있을 경우가 있고

(2) 무엇보다도 시간이 오래 걸린다. 물론 두개의 조가리를 붙이는데는 Overlap extension PCR 등을 수행하여 붙이고 이것을 벡터에 클로닝해 넣을 수도 있으나, 이것 역시 귀찮은 것은 마찬가지.

(3) 가끔은 이 과정중에서 수많은 트러블이 발생한다. 라이게이션이 안되요, 다이제이션이 불확실해요 등등..B 모 사이트에 가봐라. 아직도 ‘라이게이션이 안되여 엉엉엉’ 하는 쪼랩 대학원생들이 얼마나 많은지

이렇게 여러단계의 복잡한 클로닝을 어떻게 한번에  슥 해버릴 수 없을까? 이런 딜레머를 가지고 있는 분들에게 바로 이 Gibson Assembly라는 방법을 소개한다. 이 방법에 익숙해져 버리면 단점이 하나 있는데, 그것은 다시는 기존의 전통적인 제한효소와 Ligase를 사용하는 서브클로닝으로 컨스트럭트를 만들 엄두가 나지 않는다는 것. ㅋ

Gibson Assembly?

크레이그 벤터라고 들어보셨나? 물론 이 블로그의 애독자라면 한번쯤 들어보았을 이름. 일명 벤우석. ㅎㅇㅅ의 능력자 버전

Image

아수라 백작이 아닙니다.

다국적 컨소시움으로 구성된 휴먼 지놈 프로젝트에 맞서서 인간지놈의 사유화를 추진하다가 실패한 그 이름. 워낙 뜨는 것을 좋아하시는 분이기에 휴먼 지놈 프로젝트에 찝적거린 다음에 건드린 것은 최초의 합성유전체 미생물이다. 즉 우리가 화학적으로 합성할 수 있는 올리고 형태의 DNA를 붙이고 붙이고 붙여서 박테리아 지놈까지 만든 것.

그런데, 사실 현재의 방법으로 화학적으로 합성가능한 DNA 올리고의 길이는 기껏해야 100bp 를 좀 상회하는 정도에 불과하다. 그렇다면 이런 것을 가지고 어떻게 수 메가bp에 달하는 지놈을 만드나? 이를 위해서는 소위 다단계 합성법이 필요하다. 피라미드 판매

Image

1. 1단계는 50bp 정도 되는 oligo 를 합성하여 이를 PCR의 도움을 받아 500-1kb 정도 되는 유전자 단편을 만드는 과정. 사실 이 단계는 이미 잘 확립되어 있으며 국내외에도 유전자 합성을 해 주는 회사들은 많이 존재한다. I모라든지 B모라든지

Screenshot 2014-04-20 13.53.20

2. 이제 500-1kb 정도의 단편들을 조립하여 E.coli 에서 다룰 수 있는 최적범위인 약 10-20kb 정도의 단편으로 붙이는 과정. 바로 지금 설명할 Gibson Assembly 라는 과정은 이 단계에 해당하는 것인데 자세한 설명은 잠시 후에.

3. 이렇게 만들어진 10kb 정도의 큰 조가리를 효모에 넣어서 상동재조합 (Homologous Recombination) 을 통해서 한조각씩 붙여나가는 것

사실 올리고를 합성하고 1kb 정도의 단편을 만드는 것은 매우 잘 확립되어 있으나 문제는 이러한 몇개의 단편을 합성하여 약 10kb 정도를 조립하는 과정인데, 물론 기존의 방법론대로 제한효소자리를 넣어서 Ligation 한다든지, 아니면 단계별 PCR을 하는 방법도 있겠지만, 아무튼 손이 많이 간다. 당연히 지놈 레벨 수준의 합성을 위해서 수십, 수백개의 단편을 만드는데는 실용적이지 않다.

여기서 등장하는 방법이 바로 이 Gibson Assembly 라는 방법이고 이는 2009년에 아래 논문에 의해서 처음 소개되었다.

Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases

아마 벤터 아자씨를 별로 안좋아하는 본 블로그 주인장이 인정하는 벤터의 유일한 업적일지도

그렇다면 이 방법은 어떤 방법인가?

 

1. 일단 PCR을 이용하여 약 20-40bp의 겹치는 부분이 있도록 각각 조립할 단편을 증폭해낸다.
2. 이렇게 증폭한 PCR 단편을 몽땅 합친 다음에 Gibson Assembly Mix 와 섞는다. 이 Gibson Assembly Mix에는 다음과 같은 성분이 들어가는데

– T5 Exonuclease
– Phusion DNA Polymerase
– Taq Ligase
– dNTP
– NAD+ (Taq Ligase의 필요요소)

Screenshot 2014-04-20 19.49.27

a. 일단 T5 Exonuclease가 DNA를 갉아먹어서 single strand overhang을 만들고
b. 이렇게 만들어진 overhang끼리 서로 annealing 이 되고,
c. DNA Polymerase가 더 갉아먹은 부분을 메꾸고
d. DNA Ligase 가 Nick을 복구.

중요한 것은 이 모든 반응은 하나의 테스트 튜브에서 동시에 일어난다. 즉 실험자는 DNA만 섞어놓은 다음에 MIX 섞고 50도에서 한시간 반응하기만 하면 되는것.

3. 그 다음에 형질전환.
4. 끝. 4번단계는 없슴.  그다음에는 나온 콜로니를 스크리닝하든지 하면 되고..

“음 가만있자, 어디서 보던 테크닉 같은데…Ligation Independent Cloning과 비슷한 것 같다” 라고 생각하실 분이 있을 것이다. Ligation Independent Cloning (LIC) 이라는 테크닉 역시 overlapping 한 end 를 만든 다음에 T4 DNA Polymerase 의 exonuclease 활성을 이용하여 sticky end를 만든 다음 annealing 시켜서 결합을 시킨다. Gibson Assembly라는 테크닉은 이 방법의 확장판이라고 볼 수 있다. 다른 점은 Ligase를 소량 첨가하여 생성된 Nick을 완전히 복구해 주고, 보다 여러조각의 DNA 프래그먼트를 붙일 수 있다는 점.

그렇다면 구체적으로 어떻게 이것을 이용하여 DNA 컨스트럭트를 만들 수 있는지 살펴보도록 하자.

1. 일단 어떻게 Construct를 만들 것인지 디자인하자. 이전에 제한효소를 이용하여 컨스트럭트를 만들때는 서로 조각별로 이어붙일때 사용하는 제한효소 자리가 유전자 안에 있는지, 클로닝 사이트 때문에 불필요한 서열이 끼어들어가는지 등의 여부를 신경써야 했지만 여기서는 그딴 것 신경안써도 된다. ㅋ 그냥 원하는 부분만큼의 DNA 시퀀스를 잘라붙여서 일단 어떻게 만들지를 생각해 보도록 한다.

2. 그 다음에는 PCR Primer 디자인 작업. 기본적으로 Gibson Assembly 에서 연결되는 단편들은 옆에 이어질 단편과 같은 서열 (최소 20bp) 을 가지고 있어야 한다. 대략적으로 이런 식으로 PCR Primer를 디자인한다.

Screenshot 2014-04-20 20.07.22

3. 그 다음에는 PCR을 돌려서 Gibson Assembly 에 사용되는 단편들을 증폭해낸다. 벡터의 경우에는 벡터를 제한효소로 잘라놓은 것을 사용할 수도 있지만, 그냥 사용할 부분만큼의 벡터를 PCR 해내서 사용하는 것이 더 편리하다. “ㅎㄷㄷ 벡터를 통쨰로 PCR 한다고? 그렇게 긴 PCR이 제대로 되나?” 라고 생각할 사람도 있겠지만 요즘 나오는 Polymerase, 특히 DNA binding domain이 fusion 되어 있는 Phusion DNA Polymerase와 같은 신세대 DNA Polymerase는 High fidelity를 가지고 있으면서 보통 클로닝에 사용되는 벡터크기인 5-6kb 정도는 그냥 껌으로 PCR할 수 있다. 벡터를 PCR로 증폭해 내면, 굳이 기존의 벡터구성에 구애받지 않고, 자신이 원하는 부분만을 오려서 쓸 수 있다는 장점이 있다. 어차피 기존의 제한효소, T4 DNA Ligase 안 쓰기로 한 것이니 하려면 확실히 하자.

Screenshot 2014-04-20 20.12.59

4. 다음에는 PCR Product 정제를 한다. 젤 러닝을 해서 Gel Extraction 을 해도 되고, 그렇지 않은 경우에는 그냥 PCR Purification만을 해도 된다. 단 Plasmid Vector 를 Template로 하여 PCR을 한 경우에는 Gel Extraction을 하든지, 아니면 메틸레이션된 DNA만을 특이적으로 자르는 DpnI 같은 Restriction Enzyme 처리를 PCR 직후에 해서 Plasmid Template 가 혼입되는 것을 막아주는 것이 좋다. 그냥 귀찮으니 난 Gel Extraction 을 하지만 수백개 동시에 Construct를 만드는 분이라면 그럴 여력은 없을듯 ㅋ

5. 그다음에 PCR Product를 모두 썪어준다. 길이에 따라서 molar ratio을 맞추어주는게 좋다고 하고 농도는 대충 50ng/ul 정도는 맞춰주는게 좋다고 카드라.

6. 그 다음에 Gibson Assembly Master Mix를 섞어준다. 각각의 component (T5 Exonuclease, Taq Ligase, Phusion Polymerase 등) 을 따로 사서 만들어줄 수도 있고 (약 2-3배 정도 싸다) 그런게 귀찮으면 NEB에서 나오는 Master MIX 를 사서 쓴다. NEB에서 나오는 2X MIX의 경우에는 총 reaction volume 이 20ul 이므로 Master Mix 10ul 이고 남은 10ul 에 PCR Product 들을 섞어넣는다.

Screenshot 2014-04-20 19.49.27

7. PCR 머신 등을 이용하여 50도에서 1시간 반응

8. 그다음에 젤을 걸어 확인..이딴 거 없고 그냥 클로닝용 대장균 호스트에 형질전환 다 때려넣지 말고 약 5ul 정도만 넣으면 된다. Salt 가 많은 관계로 일렉트로포레이션 하는 분들이라면 좀 Dillution 을 하든가 salt 제거를 해야한다고 한다. 뭐 사실 Chemical 컴셀도 충분히 잘되므로 굳이 일렉트로포레이션 할 건 없을듯.

9. 그다음에 콜로니 확인. 뭐 사람에 따라서 틀리겠고, 몇개의 단편을 어셈블리하느냐에 따라서 틀리겠지만 경험적으로 3-4개 정도의 프래그먼트를 벡터에 어셈블하는 것은 나오는 콜로니 중 70-80% 는 제대로 된 콜로니였다. PCR 혹은 시퀀싱 등으로 확인후 실험에 사용. 결론적으로 우리는 이런 플라스미드를 한번에 얻게 된다.

Screenshot 2014-04-20 20.15.15

Screenshot 2014-04-20 21.17.20

얼마전에 gibson assembly후 형질전환한 plate 를 소개한다. 적색형광단백질인 mCherry에 뭔가를 달아서 발현벡터에 넣었는데, 제대로 들어간 넘들은 위에서 보는 것처럼 분홍색으로 나온다. 형질전환을 발로 해서 효율이 낮다는게 함정이지만 뭐 한마리만 나오면 되는거니 보면 알겠지만 한마리만 빼고 열댓마리 나온 콜로니가 다 분ㅋ홍ㅋ 제대로 된 insert가 들어간 넘들이다.

참 쉽죠?

Screenshot 2014-04-20 20.16.28

어째 이 얼굴이 떠오르는 대사이지만, 진짜 쉽다. 레알.

즉 이전에는 여러단계로 골치아프게 만들어야 했던 컨스트럭트들을 이제 모두 한스텝으로 만들 수 있다. 게다가 본 작업은 ‘PCR을 돌려서-섞고-형질전환’ 하는 간단한 프로시저로 되어 있으므로 한꺼번에 수십, 수백개의 컨스트럭트를 만드는 것도 그닥 어렵지 않다. CRISPR/Cas9 등과 같은 지놈 엔지니어링 기술을 이용하여 수십개의 유전자에 Knock-In을 만들고 싶은데 Donor 벡터 구축을 어떻게 할지 모르겠어~ 혹은 박테리아 지놈 내에 있는 모든 ORF를 다 PCR해서 단백질을 발현하고 싶어~ 와 같은 노가다 돋는 프로젝트를 추진한다면 이 테크닉은 진짜로 안성맞춤인 테크닉. 그러나 꼭 그런 하이스루풋 노가다 돋는 적인 실험을 하지 않고 단지 자신이 원하는 여러가지의 컨스트럭트를 만들고 싶은 사람에게도 이 테크닉은 극히 유용하다. 아마 이 테크닉의 가장 큰 단점이라면 워낙 쉽게 컨스트럭트를 만들 수 있기 때문에 자칫하다가는 자신이 만든 컨스트럭트를 가지고 해야 할 후속실험에 치여서 과로사를 할 수 있다는 것일지도 모른다. (그래서 요즘 논읽남을 할 시간이 없어졌다는 게 함정 ㅋㅋㅋ)

끝으로 이 시스템을 이용하여 할 수 있는 몇 가지 응용 예를 들어보겠다.

1. 동일 유전자의 여러군데에 point mutation을 넣고 싶을때 

가령 어떤 단백질의 active site를 알아보고 싶어서 몇가지 확인할 잔기가 있다고 치자. 4개 정도 있다고 치고, 각각에 대해서 모두 point mutation을 넣고 싶다. 어떻게 하겠는가? 흔히 많이 사용되는 QuikChange 방법에 의해서 하나 넣고, 확인한 다음, 다음 넣고..이런식으로 할수도 있다. 그러나 Gibson Assembly를 이용하면 이렇게 한번에 가능하다.

Screenshot 2014-04-20 20.27.01

요런 식으로 5개의 PCR Product를 따로 만들고, 몽땅 쌔려놓고 Gibson Assembly!

2. 동일한 유전자를 가지고 여러 종류의 construct (Fusion, Promoter, Terminator) 를 만들고 싶을때

한가지 유전자를 가지고 어떨 때는 박테리아에서 발현해보고도 싶고, 동물세포에서도 발현시켜 보고도 싶고, N-terminal tag을 서로 다른 것을 달아보고도 싶고..하고 싶은 것은 많다. 그러나 각각의 벡터에 일일히 클로닝하는게 힘들다구요? 이런식으로 모듈화시켜 부품을 만든 다음에 한큐에 어셈블리~

Screenshot 2014-04-20 20.38.02

3. 수십, 수백개의 컨스트럭트를 동시에 만들고 싶을때

수백개의 컨스트럭트를 기존의 방식대로 Restriction Digestion을 통해 만드는 것은 정말 장구한 시간이 걸리는 일일 것이다. 그러나 이러한 것도 Gibson Assembly를 통해서는 그닥 어려운 일은 아니다. 일단 수십, 수백개를 동시에 PCR하기 위해서는 가능하면 Primer를 96 well format 에 맞추어서 디자인한 후 96 Well plate로 합성한 후 (Oligomer합성하는 회사에 문의해 봐라. 가능하다) 동시에 PCR할수 있다. 그 다음에 이것을 그대로 96 well format으로 purify한 후 gibson assembly를 통하여 한번에 조립하는 것도 가능하다.

끝으로

일반적으로 몇년, 혹은 십여년 동안 동일한 일을 해와서 익숙해진 이후에는 새로운 프로토콜을 받아들이기 쉽지 않은 경우가 있다. 가령 기존의 방법대로 수십년 동안 컨스트럭트를 문제없이 만들어왔는데 왜 새로운 방법을 써야 함? 하고 생각하는 분도 있을듯. 그러나 이 방법은 충분히 그럴 만한 가치가 있는 방법이다. 일단 기존의 방벙에 비해서 훨씬 더 노동력을 절감시켜주며, 좀 더 효율적이며, 시간을 단축시켜 준다. 본 블로그 주인도 거의 이십년 가깝게 각종 재조합 DNA를 만들어 왔고 벡터 만들기에는 이골이 난 상태이지만, 이 gibson assembly라는 프로토콜은 다시 벡터 만드는 것 자체를 재미있게 해 준 메소드라는 생각이 든다.

6 thoughts on “벡터 깎던 노인의 신무기

  1. 불과 몇일 전에 이 블로그를 우연찮게 알게 된 학생입니다.
    정주행 마치고 감사한 마음에 리플 남깁니다.
    이번에 저희 랩에서 제가 처음으로 (…) CRISPR 와 micromanipulation 을 시작 하는데 정말 많은 도움이 되었어요.
    앞으로도 꾸준히 좋은글 부탁 드립니다!

  2. 안녕하세요, 사고의 깊이와 재치만점이 느껴지는 좋은 글들 잘 읽고 갑니다. ^^
    한가지 질문이 있습니다. 기존의 multi cloning site를 잘라내고 새로 만들어 넣고 싶은데
    size 는 80bp입니다. 이 것을 위해 80bp oligomer를 Forward와 reverse 모두 주문하여
    적절한 온도에서 반응시키고 이것을 insertion 으로 사용하려구요. 양 끝을 enzyme으로 잘라내구요
    두 oligomer를 붙이는 방법을 찾아보았는데 간단하긴 한데 효율이 영 좋질 않아서요, 이럴땐 무얼 찾아봐야 하는지 모르겠네요 혹시 알고계신 팁이 있다면 부탁드립니다. ^^

    • 위 글에 나온 방법이 바로 그런 목적에 매우 부합되는 실험방법입니다. 저 같으면 이렇게 하겠습니다. 즉 벡터를 통째로 PCR할 수 있도록 프라이머를 두개 디자인하고, 3′ 에 MCS를 붙입니다.단, MCS가 서로 annealing 되도록 약 20bp 정도를 겹치게 디자인합니다.

      그렇게 해서 PCR 돌리고, Gibson Assembly를 수행하면 새로운 MCS를 가진 벡터를 만들 수 있습니다.

      벡터의 길이가 얼마나 될지 모르겠지만, Phusion Polymerase 와 같이 요즘 나오는 고성능의 Polymerase를 이용하면 크게 문제가 없습니다.

      사실 저 글에 있는 Gibson Assembly 방법을 이용하면 굳이 멀티클로닝 사이트는 신경안쓰고, 바로 원하는 대로 임의의 벡터에 임의의 인서트를 붙일 수 있습니다. 저도 이 방법을 이용한지 일년 정도밖에 되지 않았는데 컨스트럭트를 한 100개 이상 만든것 같군요..컨스트럭트가 너무 쉽게 만들어지니 컨스트럭트 가지고 실험을 다 못하고 있는 지경…ㅎㅎ

  3. 우와 빠르고 깔끔한 답변 감사합니다. ^^ Gibson assembly를 읽고도 이걸어째 라고 생각했는데 다시 읽어보니 정말 좋은 방법이네요, 이 시스템 구축을 위해선 몇가지 선행작업이 필요하겠지만 하고 나면 정말 일이 수월해질 것 같습니다. 저도 앞으로 엄청난 양의 cloning을 해야 하는데 PI에게 적극 어필해 봐야 할 것 같네요 ^^ 다시 한번 감사합니다.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s