연휴의 논읽남 : 정자와 난자가 만날 때

웬 19금스러운 제목인가 싶겠지만, 논읽남입니다. 논읽남 오늘 읽어볼 논문은 이거.

Bianchi et al, Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization,  Nature 2014

정자와 난자가 만날 때 

어느 성교육 시간

얼라 “샘..아기는 어떻게 생기죠?”

샘 (쭈빗쭈빗) “아빠의 정자와 엄마의 난자가 만나서 둘이 합쳐지면…”

물론 아빠 몸 속에 있는 아빠의 정자가 엄마 몸 속에 있을 엄마의 난자가 어떻게 같은 위치에 있게 되느냐에 대한 구체적인 기작에 대해서 설명하는 게 순서겠지만 ;;; 이 부분을 어떻게 얼라들에게 설명하실지는 논읽남이 어떻게 할 일은 아니라고 생각해염. 

그런데 아빠의 정자와 엄마의 난자만 딱 있는 상황 (예:세포외수정 In vitro fertillization) 이라면 모르겠지만 아빠의 정자가 엄마의 난자를 만나기까지는 수많은 다른 세포와 스쳐지나가게 된다. 하다못해 난자에 근접한 이후에도 문제인데, 난자는 흔히 보듯이 난자만 덜렁 있는 것이 아니라 cumulus cell 이라는 세포층에 둘러싸여져 있는데, 정자는 이를 비집고 들어가서 난자를 둘러싸고 있는 ‘투명대’ (Zona pellucida)라는 단백질층을 관통해서 난자와 세포융합을 실시한다. 다른 세포는 하나도 건드리지 않고 말이다어떻게?

게다가 일단 난자에 골인~ 한 정자는 다른 정자가 들어오지 못하도록 세포막과 Zona pellucida 단백질층을 변형시켜 뒤늦게 현장에 출몰한 정자들의 침입을 원천봉쇄한다.

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즉 정자는 마치 자석에 끌리듯 난자를 찾아가서, 난자의 투명대와 세포막을 뚫고 들어가서 난자에만 융합을 하게 된다. 게다가 이 융합의 경우는 종 특이적으로써, 당연히 쥐 정자는 사람 난자를 뚫고 들어가 수정을 할 수 없으며 그 반대도 마찬가지이다. 어떻게??

정자와 난자에는 타겟인 난자를 인식하는 열쇠와 열쇠구멍에 상응하는 것이 있으며, 좀 더 생화학적으로 이야기하자면 정자 표면에 있는 ‘어떤 생체분자가’ 난자의 세포막 위에 있는 ‘어떤 생체분자’ 과 특이적으로 결합을 해야 할 것이다. 대개 이 ‘생체분자’ 는 단백질이라고 생각하는게 보통이겠고..

그러면 그게 뭔데?

가 오늘의 논읽남 주제.

Izumo

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 한 10년 전에 정자 표면에 Izumo 라는 단백질이 존재하고, 이 단백질이 정자가 난자를 인지하는데 특이적인 ‘열쇠’ 로 작용하는 것이 확인되었다. 즉 이 유전자가 낙아웃된 쥐에서 나온 정자는 난자에 못 들어가고 당연히 불임.  난자가 저기 있는데 왜 합체를 못하니

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그렇다면 정자 표면 위에 존재하는 Izumo라는 단백질은 어떤 단백질인가? Immunogloblin하고 비슷하게 생긴 막 단백질.

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원래는 이 단백질이 기존에 난자표면에 존재하는 단백질이고, 이것이 없으면 불임이 유발되는 단백질인 CD9 이라는 단백질과 서로 상호관계인줄 알았다. 그러나 그렇지 않았다. 그렇다면 Izumo와 서로 작용하여 정자를 난자내로 들여보내는 단백질은 과연 무엇일까? 그게 약 10년 동안 찾아지지 않았다.

짚신의 짝을 찾는 방법

생체내에서의 많은 생명현상은 단백질간의 상호작용 (Protein-Protein Interaction) 에 의해서 일어나는 경우가 허다하고, 어떠한 단백질이 어떤 생명현상에 관여한다는 것이 발견되면, 다음 과제는 이 단백질과 상호작용을 하는 단백질이 어떤 것일까인지를 아는 것이다. 그렇다면 이런 단백질을 찾으려면 어떻게 해야하나?

흔히 단백질 상호작용을 찾을때 많이 사용되는 유전적인 방법으로는 “Yeast two-hybrid” 와 같은 시스템이 있고, 생화학적인 방법론으로는 GST pulldown 혹은 immunoprecipitation 등에 의해서 같이 딸려나오는 단백질을 프로테오믹스적인 방법으로 확인하여 찾는 등의 방법이 있을 수 있겠다. 그러나 본 논문에서는 이런 방법이 아닌 조금은 색다른 방법에 의해서 Imuzo 의 파트너를 찾게 되었다. 물론 해당 연구자들도 기존에 잘 알려진 방법들을 먼저 시도해 봤겠지. 그러나 그런게 안되니 10년동안 그 파트너를 발견하지 못한 것이겠고 ㅋㅋ  몇 가지 문제가 있었는데, 결합력이 많이 낮았고, 특히 Pulldown과 같은 방법으로 단백질을 분리하기에는 난자라는 샘플은 그닥 양이 충분하지 못해서 쿨럭..

여튼 이 사람들은 Izumo의 ectodomain만을 HEK293T 세포에서 발현하여 이것을 일종의 Probe로 사용하기로 하였다. 단, 단백질의 리셉터에 대한 결합력을 늘리기 위하여 단백질을 pentamer로 만드는 도메인과 fusion 한 단백질을 만들었고 뒤에 디텍션을 위한 FLAG tag, 정제를 위한 His tag을 달았다.

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그래서 이 단백질 프로브를 난자에  Immunostaining하듯 붙이고 Anti-FLAG 으로 염색해 보니 난자의 세포막에 슥~ izumo 단백질이 달라붙는 것을 알 수 있었다.

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그러나 HEK293T 세포 등과 같이 Izumo 리셉터 가 없는 세포에는 당연히 Izumo 단백질은 붙지 않는다.

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요런 성질을 이용하여 Izumo 단백질에 붙는 유전자를 클로닝하기 위해서 Expression cloning방법을 시도하였다.  이전에 80-90년대에 미지의 유전자를 찾을때는  많이 사용하던 방법이었는데지놈 시대에  넘의 Expression Cloning 이냐 생각하겠지만나중에 보면 알겠지만 시퀀스 호몰로지만으로 모든 유전자를 찾을 수는 없는거란다 얼라들야..

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마우스 난자 유래의 expression cDNA 라이브러리를 일단 대장균에 형질전환한후 한 플레이트에 약 100개 정도의 콜로니 (각각 다른 유전자가 들어있을) 가 나오게 깔고 이것을 360 플레이트를 깔았다. 그 다음에 플레이트에 있는 박테리아를 몽땅 합쳐서 플라스미드를  뽑음. 그러면 대충 랜덤하게 100개 정도씩의 클론이 합쳐진 풀이 360개 정도 나오겠지?  뭐 삼빡하게 360개 미니프랩 하면 됩니다 

그래서 약 360종류의 풀링된 플라스미드를 각각 HEK293 세포에 형질전환. 그 다음에 Izumo 단백질 깔고, Izumo 단백질이 멤브레인에 붙어있는지를 Immunostaining으로 디텍션.  그중 하나의 Pool에서 시그널이 나오는 넘이 잡힘.

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(약 100개 정도의 클론이 들어있을) 64번 Pool 을 다시 대장균에 형질전환해서 나오는 콜로니를 다 미니프랩 ㅋ

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그걸 다시 12개씩 썪어서 그룹별로 테스트.

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12개중 B2라는 넘이 당첨! 시퀀싱을 해보니

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기존에 folic acid receptor 로 알려졌던 유전자의 homolog로 db에 등록되어 있던 넘이다. (Folr4로 등록됨) 근데 시퀀스를 살펴보니 Folic acid 의 결합에 필요한 보존된 서열 중 몇개가 이가 빠져 있음. 그리고 folic acid 결합력을 조사해 보니,

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안붙음 ㅋ 이건 folic acid receptor 가 아님. 그래서 새로운 이름을 지었음. Juno. 이걸 보면서 느끼는 게 뭐 없으신지? 지놈 시퀀싱을 통해서 많은 유전자들의 기능이 단지 단백질 상동성만으로 무슨 단백질이라고 추측되곤 하는데 (생화학적인 분석도 없이) 이게 꼭 정확하지 않을수도 있다는 이야기지..

Juno

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여튼, 이 Juno라는 단백질에 대한 항체를 만들어 보니 난자의 세포막에 왕창 존재하는 것을 알 수 있었음.

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Juno 대한 항체를 처리하면 Izumo1 probe 난자의 막에 더이상 붙지 않음 Juno 항체가 Izumo1 Juno 상호작용을 블락한다는 이야기임

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정제된 Izumo와 Juno는 서로 상호작용을 (약하게) 하며(A) 시퀀스가 유사한 Folic acid receptor 들은 Izumo 와 상호작용을 하지 못하며 (B) 사람, 쥐, 돼지 등 포유류에서 Izumo와 Juno는 동일하게 상호작용을 한다는 이야기. 즉 포유류에서는 보존된 기작이라는 말씀

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그렇다면  단백질 간의 상호작용을 방해하면 난자와 정자가 수정되는 것을 방해할  있는가

마우스 정자와 난자 섞고 체외수정을 시도할때 Izumo Juno 항체를 넣어주면 수정 안됨

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낙아웃 쥐를 만들어 보니 Juno 유전자가 homozygote knockout   쥐는 새끼 못 낳음. 

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Juno (-/-) 쥐의 난자와 정자가 만나면 어떻게 되나 살펴보니 정자가 투명대는 통과하지만 투명대와 난자 사이의 공간인 위란강 (Perivitelline space) 에 정자가 몰려있음.  표면에 Juno 없는 난자는 정자가 뚫고들어갈  읍슴. 고지가 저기인데 왜 깃발을 못 꽂니

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못 뚫고 간다니까요

즉 Izumo 와 Juno의 상호작용은 정자가 수정후에 난자의 막을 뚫고들어가는 필수요소라는것이 입증되었다.  그런데 여기서 한가지. 수억마리의 정자가 난자로 비집고 들어가지만, 골인을 하는 넘은 딱 한마리. 일단 한마리가 골인을 한 다음에는 난자의 세포막에 ‘어떤’ 변화가 생겨서 더 이상 정자가 뚫고들어올수는 없게 된다. 그게 어떻게 일어나는가?  바로 여기서 밝혀진 Juno가 이 현상 (Cortical Reaction 이라고들 한다) 의 중심이 되는 단백질이라는 것이 밝혀졌다.

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 성숙된 난자 (Metaphase II) 에서는 Juno 세포막에 잔뜩 존재하지만수정 직후에 Juno 스르르 사라지며수정이 일어나면 완전히 세포막에서 사라지게 되고따라서 추가로 들어오는 정자의 침입을 원천봉쇄 

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EM 찍어보니까수정이 되면 Juno (쩜쩜으로 표시된 것들 세포막에서 스르르 덤프되서 방출된다는  확인됨 

 

그래서 어쩌라고

여기서 발견된 두개의 단백질의 상호작용은 꽤 의미가 있는데, 일단 해당 단백질이 수정과정에서 핵심적인 역할을 한다는 것이 알려졌으므로 불임 진단 등에서 꽤 유용하게 사용될 것이다. 단, 이 경우에는 단지 정자가 난자의 막을 뚫지 못한다는 것 뿐이므로 정자를 미세조작기로 찝어서 난자안에 찔러넣는 기술인 Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) 를 이용하면 정상적인 수정이 가능하므로 큰 문제는 되지 않을 것이다.

보다 더 재미있을 응용이라면 해당 단백질간의 상호작용을 방해하는 small molecule inhibitor 라든지 이런게 있다면 이것은 수정 과정을 직접적으로 막는 신개념 피임제제로 응용될 수도 있지 않을까. 물론 이를 위해서는 Juno – Izumo간의 단백질 결합구조를 규명하는 것도 필요할 것 같고…아니면 말고.

오카모토(주) 사장님이 이 논문을 싫어합니다

 

 

4 thoughts on “연휴의 논읽남 : 정자와 난자가 만날 때

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