단백질 정제의 십계명 4. 친화크로마토그래피(Affinity Chromatography)와 친하게 지내라

이전까지 다룬 것들은 다음과 같다.
단백질 정제의 십계명

1. 단백질은 단백질마다 다 다르니 그들의 특성을 잘 파악할지어다.
2. 폴리펩타이드 결합은 언젠가 끊어질지니 단백질 분해효소에 유의할지어다
3. 과발현을 경배하라

단백질 정제의 치트키

그동안 알아본 내용들이 결국단백질을 정제하는데 필요한 준비였다면 이제서야 본격적으로 단백질을 정제하는 이야기라고 하겠는데 여러가지 단백질 정제 테크닉중 현대의 단백질 정제에서 가장 중요한 기술을 딱 한 가지만 이야기하자면? 친화크로마토그래피 (Affinity Chromatography) 되겠습니다.

친화크로마토그래피의 원리는 어찌 보면 간단함.

그동안 단백질 정제에 대해서 알아보면서 귀에 못이 박히도록 떠든 이야기가 뭔가? “단백질은 그때그때 단백질마다 틀려요” 지? 결국 단백질 정제라는 것은 이런 제각각의 다른 성질을 가진 단백질 중에서 자신이 원하는 단백질만을 슥 골라내는 일이다.


온갖 다양한 성질을 가지는 단백질 중에서 자신이 목적하는 단백질에만 특이적으로 결합하는 레진을 이용하여 자신이 원하는 단백질만을 스윽~ 골라내는 친화크로마토그래피는 단백질 정제에 가장 이상적인 툴로 생각된다.

그러나 친화크로마토그래피가 어떤 단백질 정제에서건 필수적인 툴이 된지는 생각만큼 오래된 일은 아니다. 친화크로마토그래피가 단백질 정제의 기본 툴이 된 것은 아마도 재조합 DNA 기술에 의해 단백질을 마음대로 조작할 수 있게 된 1980년대 이후라고 봐야 된다.

물론 그 이전에도 단백질의 특이적인 성질을 이용하는 친화크로마토그래피는 여러가지 단백질의 정제에 사용되었다. 가령 DNA 에 결합하는 전사인자들은 DNA가 고정화된 컬럼을 통해서 정제했다든지 (‘셀책‘ 을 쓴 Bruce Albert 아저씨가 기회날때마다 자랑하는게 바로 이 이야기임) 아주 많은 효소의 기질로 사용되는 ATP 를 이용하여 ATP에 결합활성이 있는 단백질을 정제한다든지…그러나 단백질은 단백질마다 각각 틀리다는 특성을 감안한다면 친화크로마토그래피는 재조합 DNA 이전에는 극히 일부의 단백질의 정제에 개별적으로 사용된 마이너적인 테크닉에 불과했다고 볼 수 있다.

골백년 전에 개발하신 DNA 친화크로마토그래피를 기회만 나면 자랑하시는 브루스 알버트 아저씨. 아저씨는 그저 셀책셔틀일뿐이잖아요

그러나 재조합 DNA 기술에 의해서 어떠한 단백질도 융합단백질을 만들어 낼 수 있게 됨에 따라서, 친화크로마토그래피는 거의 모든 단백질의 정제에 공통적으로 이용할 수 있는 툴, 일종의 치트키가 되버렸다. 그렇다면 어떠한 단백질도 몇 가지의 방법으로 정제할 수 있는 “치트키” 의 실체인 어피니티 태그 (Affinity Tag)에 대해서 알아보자.

어피니티 태그

어피니티 태그를 간단하게 정의하면 ” 임의의 단백질과 융합되어 해당 융합단백질을 쉽게 정제할 수 있게 하는 특정한 물질에 친화력이 있는 단백질쪼가리” 라고 할 수 있겠다. 가령 생체내에서 산화환원을 조절하는 물질인 글루타치온 (GSH) 은 극히 일부의 단백질에만 친화력을 지니는데, 개중 하나가 글루타치온을 다른 물질에 붙여주는 단백질인 글루타치온 전이효소 (Glutathione S transferase,GST) 같은 것이다. 이 단백질은 글루타치온을 고정화한 레진에 매우 잘 붙음.

그렇다면 우리가 목적하는 다른 단백질을 (DNA 재조합 기술을 이용하여) GST라는 단백질과 융합시키면, 다른 목적단백질 (원래는 글루타치온과 친화력이 전혀 없는) 을 글루타치온을 고정화한 레진에 역시 잘 들러붙는다. 다른 단백질은 대개 글루타치온과 친화력이 없으니 슥슥 빠져 나가겠지? 그 다음에 버퍼에 과량의 글루타치온을 섞어서 넣어주면, 레진에 들러붙은 단백질만 회수 가능. 단백질 정제 완료 ㅋ

간단한가? 물론 이론상으로는 간단하지만, 여러가지 신경써야 할 것들이 있다.

각종 어피니티 태그의 특징

1. His-tag / Ni-NTA

Screenshot 2014-07-24 03.41.11

개요: 6개 (혹은 8개)의 히스티딘을 연속으로 달아놓으면 니켈 등의 금속이온과 배위결합을 생성하게 된다. 니켈이 위의 그림처럼 레진에 결합되어 있으면 히스티딘을 죽 달아두면 니켈 결합 레진에 단백질이 달라붙게 되는데 (니켈을 고정하기 위해서 흔히 Nitrilotriacetic acid (NTA)라는 물질을 사용한다) 이러한 성질을 이용하여 단백질을 정제하는 방법이다. 아마도 오늘날 재조합 단백질을 정제하는데 가장 많이 사용되는 방법이라고 봐도 된다.

일단 레진에 결합된 단백질은 과량의 이미다졸 (Imidazole) 혹은 pH의 변화에 따라서 회수 가능.

Screenshot 2014-07-24 03.42.42
겨울왕국의 엘사가 좋아할 파란색은 니켈 덕

장점

  •  태그가 매우 작다. 약 20 아미노산. 웬만하면 다른 단백질에 결합되어도 단백질의 기능에 큰 영향을 미치지 않을 가능성이 높다. 게다가 MBP, thioredoxin, SUMO 등과 같이 다른 어피니티 태그와 같이 사용가능하다.
  •  N 혹은 C 말단에 선택적으로 달아야 하는 대개의 태그와는 달리 N말단이든 C말단이든 가리지 않고 결합가능.
  • 1ml 당 결합하는 단백질의 양이 많기 때문에 (10mg 이상) 정제후에 매우 높은 농도로 단백질을 농축가능.
  •  다른 태그와는 달리 Denaturation 조건, 즉 6M Urea와 같은 조건에서도 작동함. 가령 Inclusion body 로 떨어진 단백질을 정제하고자 할때, 6M Urea 등으로 녹인 후에도 사용가능함.
  • 태그가 작은 편이므로 굳이 벡터에 클로닝하지 않고 PCR 등으로 히스티딘 6개 및 링커 시퀀스를 달아서 도입할수도 있음

단점

  •  비특이적 결합이 많음. 발현수준이 높을 경우에는 크게 상관없으나 낮을 경우에는 매우 많은 잡뺀드를 보게됨. 이를 줄이기 위해서는 꽤 stringent한 조건으로 (25mM Imidazole 함유 버퍼 등) 빡세게 워싱을 해야 함.
  •  불용성의 성질인 단백질을 수용성으로 유도하는 것은 그닥 기대하기 힘듬.
  • 버퍼에서 이리저리 가리는 게 꽤 많음. 보통 단백질 분해효소 저해제로 많이 넣는 EDTA 넣으면 ㅋ 안됨. (EDTA는 2가 양이온 킬레이터이기 때문에 니켈을 다 떼버림). DTT를 1mM 이상 버퍼에 넣을 경우 니켈이 산화되는 경우가 많음

2. GST / GSH

개요: 앞에서도 잠시 설명한 것처럼 Glutathion S-transferase (GST) 라는 단백질이 글루타치온 (GSH)에 친화력을 가지는 것을 이용함. 즉 글루타치온이 결합된 아가로스 레진을 어피니티 레진으로 이용하며, 목적단백질은 GST의 C말단에 융합되서 발현됨. 결합된 단백질은 워싱 후에 GSH가 함유된 버퍼를 이용하여 회수함.

장점

    • 선택성이 높은 관계로 단백질 발현수준이 낮아도 상대적으로 깨끗한 결과물을 가져다줄 가능성이 높음.
    •  따라서 단백질 정제 외에도 Pulldown 과 같이 미지의 단백질 결합파트너를 찾는 실험에도 널리 사용.
    •   보통 단백질 정제를 많이 안하는 사람은 GST 외에 다른거 잘 몰라서…장점 맞음? -.-;;

단점

    • 상대적으로 큰 tag (25kDa) 이다. 상당수의 경우 tag이 달림에 따라서 목적단백질의 활성이 저해될 가능성이 있으므로 많은 경우 tag을 잘라주어야 하는 경우가 있다.
    • GST는 자체적으로 dimer를 형성한다. 따라서 GST 에 퓨전되는것만으로 목적단백질 자체도 dimer가 되는 셈이고, 이에 따라 예기치 않은 특성이 나타날 경우가 있다.
    • 뒤에서 소개할 다른 태그 (MBP, SUMO, thioredoxin) 등과 같이 불용성의 성질인 단백질을 soluble 로 유도하는 성질은 거의 없는 편.

3. MBP / Maltose

개요: 대장균 유래의 말토스 결합단백질 (Maltose Binding Protein) 을 이용한 어피니티 태그. 융합단백질은 아밀로스 (amylose) 가 결합된 아가로스 레진에 결합하게 되며, 단백질은 말토스가 함유된 버퍼로 회수됨.

장점

  • 원래는 이 목적으로 개발된 태그은 아니었지만 현재까지 이 태그가 사용되는 것은 MBP에 단백질을 달아두면 상당수의 불용성 단백질이 수용성으로 나온다는 성질이 있기 때문.
  • 발현레벨이 상당히 높은 편이라서 발현이 잘 되지 않는 단백질을 여기에 융합시키면 발현양이 증가되는 경우가 많음.

단점

  • 태그가 매우 큰 (40kDa) 편. 웬만하면 잘라야 함.
  • 퓨전이 되지 않았을 경우에는 어피니티 레진인 아밀로스 레진에 잘 붙으나, 단백질이 퓨전되면 아밀로스 레진에의 결합력이 떨어지는 경우가 많이 있음. 이를 극복하기 위하여 N말단에 His-tag과 같은 별도의 태그를 추가로 달아두는 경우가 많음. 이 경우에는 MBP 태그는 정제보다는 단백질의 발현을 촉진하기 위해서 사용되는 편.
  • 사용되는 레진은 내구성이 상당히 낮은 관계로 그닥 많이 재활용을 할 수 없는 편.

4. Intein/Chitin-binding

개요 :
위에서 설명한 모든 융합단백질 태그의 경우는 이제 필요가 없어지면 특이적인 단백질 분해효소를 이용하여 태그와 목적단백질 사이를 끊어내야 한다. 그러나 만약 어피니티 태그가 자체가 필요가 없어지면 그냥 셀프 -.- 로 목적단백질과 끊어져 버린다면 얼마나 좋을까? 아 예 고갱님 주문하신 제품이 있습니다 단백질 중에서는 희한하게도 두개의 별도의 폴리펩타이드 체인으로 발현되어 단백질이 서로 융합되는 것들이 종종 있음. 마치 진핵생물의 mRNA가 스플라이싱을 통하여 엑손영역만 결합되듯이. 이러한 단백질 부분을 ‘인테인’ (Intein) 이라고 함.

Screenshot 2014-07-24 12.47.39

이런 희한한 현상을 단백질 정제에 이용하는 시스템이 존재함.

Screenshot 2014-07-24 12.49.37

현재 상용화된 Intein system의 경우, 매우 강한 환원조건 (25mM 이상의 DTT) 을 주었을 경우 자가분해가 됨. 이러한 활성을 이용하여 여기에 셀룰로스 결합도메인 (CBD)을 결합한 시스템이 ‘Impact  System’ 이라는 이름으로 상용화되어 있다. 과정은 일반적인 Affinity chromatography와 동일하게 단백질을 Intein tag 과 융합시켜 발현하고 Chitin bead에 흘려보내면, 융합단백질은 셀룰로스 결합도메인을 통해 Chitin bead 에 결합하게 된다.

여기서 한가지 다른 친화크로마토그래피와 틀린 점이 있다면, 다른 친화크로마토그래피는 목적단백질을 회수할때 해당 태그에 붙을 수 있는 리간드를 과량으로 넣어주어서 흘려내지만, 이 시스템에서는 목적단백질을 회수할때 Intein의 자가분해 활성을 이용한다는 것임. 즉 워싱이 끝난 후에 25mM DTT가 함유된 버퍼로 버퍼를 갈아준 후 16-24시간동안 내버려둠. 이 시간동안 Intein tag은 자가분해 활성에 의해 목적단백질과 서로 분리되고, 목적단백질은 bead에 더 이상 붙어있지 않으므로 레진에서 나오는 단백질국물을 받아내기만 하면 됨. 참

장점

– 별도의 protease를 이용하여 cleavage를 할 필요가 없음! 따라서 별도의 protease digestion, 안 잘린 것과 protease에서 잘린 넘을 정제하는 과정 등의 잡스러운 과정을 모두 피할 수 있음.

– 일단 chitin affinity를 이용하여 붙이고, self proteolysis를 통해서 끊어져 나온 것을 받아내는 과정에서 레진에 결합하는 대부분의 비특이적 결합은 배제할 수 있음. 따라서 다른 어피니티 태그에 비해서 산출물이 보다 깨끗한 편.

단점

– 상대적으로 tag가 큰 편 (40kDa)

– 목적단백질이 soluble하지 않은 경우 self proteolysis는 일어나지만, 그 상태로 레진에 엉겨서 일루션이 되지 않는 경우가 가끔 있음. 단백질이 저기 있는데 왜 먹지를 못하니


5. FLAG, HA, Myc..

특정한 짧은 아미노산에 특이적으로 반응하는 항체들이 많이 개발되어 있는데, 이들을 에피토프 태그 (Epitope tag)라고 부름. 가령 ” DYKDDDDK” 와 같은 서열에 특이적으로 인식하는 항체가 개발되어 있는데 이것은 FLAG tag 이라고 부름. 이렇게 특정한 짧은 아미노산 서열을 선택적으로 인식하는 항체는 두가지 용도로 쓰이는데,

1. 특정한 태그가 달린 단백질을 검출 : 즉 특정한 단백질에 특이적인 항체가 없는 상황에서도 단백질을 웨스턴 블랏, 혹은 이뮤노스테이닝 등으로 단백질을 검출할 수 있음.

2. 해당하는 항체가 고정화된 비드를 이용하여 해당 단백질을 분리할 수 있음.

여러종류의 에피토프 태그가 개발되어 있는데 많이 사용하는 것으로는 FLAG (DYKDDDK 를 특이적으로 인식), Myc (EQKLISEED), V5 (GKPIPNPLLGLDST), HA (YPYDVPDYA) 가 있음. 만약 단백질 정제에 응용하는 경우 해당하는 tag를 인식하는 항체가 고정화된 비드를 어피니티 비드로 사용하게 된다.

이러한 태그는 매우 특이성이 높은 관계로 동물세포 등과 같이 단백질 발현수준이 낮은 발현시스템에서 단백질을 정제할 때 많이 사용됨. 또한 단백질 정제뿐만 아니라 생체 내에서 해당 단백질과 결합되어 있는 다른 단백질이 어떤 것이 있는지를 보기 위한 Immoprecipitation 등과 같은 실험에도 널리 이용함.

단점이라면? 아무래도 다른 어피니티 레진에 비해서 항체를 이용하는 레진의 경우 가격대가 비싸고, 따라서 다량의 단백질을 정제할때 사용하기는 여러가지 난점이 있다는 것일듯.
물론 이외에 설명하지 않은 어피니티 태그가 있을 수 있겠지만 과감히 무시하고 (답답하면 메이저 어피니티 태그가 되던지)

붙일 때는 붙이지만 자를 때는 잘라내야 하느니라

어피니티 태그를 이용하여 단백질을 거의 원스탭으로 정제를 할때까지는 좋음. 그러나 이제 정제가 된 이상 단백질에 붙어있는 어피니티 태그는 그저 잉여일 뿐. 토사구팽이 웬말이요 물론 태그가 붙어있는 상태에서도 단백질을 사용할 수 있는 상황이라면 상관없지만, 구조를 결정하기 위한 목적으로 단백질을 정제했다든지, 아니면 단백질의 활성이 태그때문에 방해가 된다든지 하는 경우에는 가차없이 태그를 원하는 단백질에서 잘라내야만 한다.

어떻게?

대개 이런 경우를 위해서 목적하는 단백질과 태그 사이에는 특이적인 단백질 분해효소 인식부위를 달아놓기 마련이다. 그렇게 해서 가장 많이 사용되는 단백질 분해효소에는 Thrombin, Factor Xa 등등 여러가지가 있었지만 요즘 대세는 역시 Tobacco etch virus protease, 약칭 TEV Protease이다. 엣지있는 바이러스

Tobacco etch virus는 식물 유래의 바이러스로써 이 지놈에는 바이러스 유래 단백질을 잘라낼 수 있는 분해효소가 들어있는데, 이 단백질 분해효소는 매우 특이적인 인식부위를 가지고, 여기에서 벗어나는 인식부위는 거의 자르지 않는다는 특징을 가지고 있다. 기존에 많이 사용되던 thrombin이나 Factor Xa 등은 어느정도의 서열특이성은 가지고 있지만 이것이 완벽하지 않아서 자칫 자신의 목적단백질 안까지 잘라버리는 일이 많았었다. 그러나 TEV Protease의 경우에는 이런 염려없이 사용가능하다.

친화크로마토그래피를 위해서는 뭔가를 달아야 한다는 편견을 버려!

지금까지는 재조합 단백질을 정제하기 위해서 유전자에 뭔가를 결합시켜 융합단백질을 만드는 것 위주로 설명했다. 그러나 상당수의 단백질들은 생체 내에서 ‘뭔가’ 와 결합하고 있고, 따라서 이러한 단백질마다 고유한 친화도를 가진 물질을 이용하여 친화크로마토그래피를 하는 것 역시 가능하다. 그러나 문제는 “그때그때 다른 단백질” 에 따라서 각기 다른 친화크로마토그래피를 개발하는 것이겠지

가령 IgG 등의 항체의 경우에는 박테리아 유래의 단백질인 Protein G 혹은 Protein A 와 매우 특이적으로 결합하는 성질을 가지고 있는데 이를 이용하여 Protein G 혹은 Protein A가 고정된 비드를 이용하여 혈청 내에서 IgG 등의 항체를 정제하는 것은 매우 일반적인 방법이다.
IgG Heavy Chain에 결합한 Protein AProteinA

Screenshot 2014-07-24 19.15.29
Protein A가 고정된 레진으로 이뮤노글로블린을 혈청에서 원스탭으로 정제

또한 특정한 단백질에 특이적인 항체를 가지고 있을 경우는 이는 이상적인 친화크로마토그래피라고도 할 수 있는데, 이 경우는 항체를 레진에 고정하여 항체가 인식하는 단백질만을 정제할 수 있다. 흔히 많이 사용되는 ‘Immunoprecipitation’ 은 특정한 단백질을 인식하는 항체와 항체와 특이적으로 결합하는 Protein A 등이 고정된 비드를 사용한다. 물론 특정한 단백질에 특이적인 항체를 분리하기 위해서 반대로 특정한 단백질을 고정화하여 항체를 분리할 수도 있고.

단백질 정제는 이것으로 끝?

지금까지 설명한 것처럼 친화크로마토그래피는 오늘날 단백질 정제에 사용되는 테크닉 중 첫손가락에 꼽히는 테크닉이라고 말할 수 있다. 이전에 단백질을 정제하기 위해서 수십 kg 의 조직을 파쇄하여 단백질 국물을 만들고 여기서부터 컬럼에 컬럼에 컬럼을 연속하여 밥도 안먹고 잠도 안자고 단백질을 정제하던 조상님들이 현대의 생물학자들이 간단하게 어피니티 태그를 달아서 원스탭으로 단백질을 정제하는 것을 보면 참 한숨이 나올지도 모른다.

Screenshot 2014-07-24 19.23.14

쪼랩들이 원스탭으로 단백질을 슥슥 정제하는 것을 본 왕년의 생화학자들. 자기네들은 단백질 정제해서 실험 몇가지만 하면 졸업했었음에도 불구하고 요즘 애들이 편하게 일하는 것은 좀 보기 그렇지 응?

사실 요즘 단백질 정제하는 분들의 상당수는 이렇게 친화크로마토그래피 1단계만 가지고도 자신의 용도에 충분히 쓸만한 순도의 단백질을 정제하곤 한다. 그러나 기억해두어야 할 것은 ‘단백질 순도는 용도에 따라서 각각 달라요’ 라는 말이다. 만약 친화크로마토그래피 정도로 충분히 정제된 단백질을 얻지 못한다면? 그때는 이전부터 내려오던 여러가지 단백질 정제 테크닉이 필수적으로 등장해야 한다. 여기에 대해서는 다음 계명에서..

19 thoughts on “단백질 정제의 십계명 4. 친화크로마토그래피(Affinity Chromatography)와 친하게 지내라

  1. 글 올라올 때마다 너무 재밌게 잘 보고 있습니다. 저는 학부 땐 생화학 1만 들었는데 어쩌다보니 바이오를 하고 있는 박사과정 학생인데, 올리신 글들이 진짜 유용하기도 하고 공감되기도 하고 그러네요. 하시는 연구 대박 나시길!

  2. 안녕하세요. 현재 ~130kD 정도 되는 큰 단백질을 GST tag를 달아 발현시키려고 하는 학생인데요.. GST protein임에도 불구하고 GST-cleavage+main band 이외에 수많은 잡밴드들이뜹니다. 포닥분들께 물어보니까 his-tag아니냐고 놀랄정도로 많이 뜨는데요.. 혹시 이런경우 해결책 아시나요? 감사합니다.

    • 그 ‘잡밴드’중에는 진짜 잡밴드도 있겠지만 단백질의 크기를 고려한다면 목적단백질이 Degradation 된 것들도 있을것입니다. 최대한 degradation을 줄이도록 발현시간 최소한+눈썹이 휘날리도록 빨리 정제를 진행해 보시구요..

    • C 말단에 his tag을 추가로 달아 풀렝스만 정제하는 방법도 있겠고, ion exhange, gel filtration 등을 통해 추가정제릉 하는법, 목적에 따리 틀리겠지만 일부만을 발현하는 법 등등 많습니다

      • 최근 글 다 읽고 purification은 12L를 4시간만에 다 끝냈습니다. 잡밴드는 확실히 조금 (?) 느낌상 줄어든거 같긴 하네요. 우선 감사합니다!

      • 아 또 질문이 있는데요. 저희 실험실에서는 leupeptin하고 PMSF만 protease inhibitor로 쓰는데요.. 혹시 cocktail이나 그런걸 안써서 이런 결과가 나올수도 있을까요?

      • 그리고 가장 큰 문제는… 이게 AKTA (SourceQ)로 내린다음에도 degraded product가 purify 가 되지않네요.. SQ 내린다음에 일단은 Superdex (gel filtration)을 하는게 맞을까요?

      • 1. Leupentin은 cystein protease inhibitor고 PMSF는 serine protease inhibitor 이고 cocktail이라는것은 여기에 좀 더 잡다하게 섞어놓은건데 글쎄요…큰 차이가 있을것 같지는 않네요.

        2. Main Band와 Major degradation product와의 사이즈 차이가 크다면 (두서너배 차이) GF로 purification이 가능합니다만 별로 없거나 (가령 130과 110) 한다면 GF로 purify는 힘들수 있어요.

        3. GST로 Purification 한다면 construct를 하나더 만들어 C-term에 Histag 달고 GST하고 다음에 바로 His tag 하는 식으로 양쪽끝에 tag가 살아있는 넘만 골라내는 것도 가능합니다.

        4. 그리고 가끔은 degradation되서 PAGE상으로는 두동강이 났지만 실제 단백질로는 붙어있는 경우가 있는데 (loop 형식으로 연결된 부분은 끊어졌지만 전체적으로는 한덩어리가 났다든지) 이경우에는 꽤 어렵습니다.

        5. 문제는 결국 정제를 해서 뭐할것이냐, full length가 꼭 필요하냐, 어느정도 순도가 있는넘이 필요하냐 등에 따라서 차후 전략을 모색하는게 좋습니다.

    • 답변 감사합니다. 일단은 SourceQ로 했을때는 결과물이
      Peak (1 — GST) Peak (2– SND1+other products)
      이렇게 나오고 Peak 2를 젤로 내려보면
      Main band
      non-specific
      non-specific
      non-specific
      non-specific
      non-specific
      GST

      이렇게 나옵니다. 사실 degradation이 유일한 추측이구요. GST가 cleaved되면서 프로틴이 C to N terminal로 degradation이 일어난다는;; 음 저만의 유일한 생각이구요.

      사실 1-885 full length인데 16-885로 almost full length로 진행하고 있습니다. 우선은 #3하고 다른 랩에 부탁해서 MBP를 한번 시도해볼 생각입니다.

  3. 와 ㅋㅋㅋㅋ 정말 쉽고 재미있게 설명해주시네요. 레포트 쓰다가 우연찮게 발견한 사이트인데

    보물을 발견한 기분입니다. 앞으로 북마크 해놓고 모르는것 있으면 자주 들르겠습니다!

    감사해요ㅎㅎ

  4. 음… ㅋㅋㅋ 기다리다가 지쳐서 궁금해서 그런데요…. 혹시 남은 6계명이 뭔지만 간단히 리스트해줄 수 있으세요? 감사합니다.🙂

  5. 학교에서 배울땐 힘들었는데 매드님꺼 읽으니까 굉장히 쉽네요….는 거짓말이고 재미가 있어서 자주 읽게되네요 ㅎㅎ 다음 계명은 언제 나오나요 ㅠㅠ

  6. 이미다졸은 왜 넣어주는건가요 ? 히스티딘과 결합하여 니켈에서부터 히스티딘결합된단백질이 이미다졸과 결합하여 떨어져나오는건가요 ? ㅜㅠ 무슨결합이죠 배위결합인가요 ? 알고싶습니다. !!

  7. 글 정말 잘보고 갑니다!! 제가 아직 많이 부족한 학부생이라 이해가 잘 안되는게 있는데
    Glutathione s transferase 를 이용하여 GSH에 붙고 다시 GSH를 섞은 버퍼로 떼어낸다는 게 잘 이해가 안됩니다.. GSH가 대신 레진에 붙어서 Glutathione s transferase 를 떼어내는 것인가요??

    • GST는 GSH가 연결된 레진에 GSH를 통해 붙는데 GST와 GSH의 결합은 뽄드처럼 절대 안떨어지는 결합은 아닙니다. 그런데 여기에 과량의 레진에 결합안된 GSH를 넣으면 잠깐 떨어진 GST는 GSH에 붙을테고, 레진의 GSH와 경쟁을 하니 결국 레진에서 떨어져 나옵니다

  8. 안녕하세요! 글 잘 보고 갑니다. 근데 중간에 이해가 잘 안된느 부분이있는데
    GST에 유전자재조합기술을 이용하여 단백질을 붙인다고 하셨는데
    이게 어떤방법인가요? lac operon과 관련된 것인가요?

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s