오늘의 논읽남 : 세포막을 여는 마법의 열쇠

오늘 읽어볼 논문은 다음 논문이 되겠다.

D’Astolfo et al., Efficient Intracellular Delivery of Native Proteins, Cell 2015

문을 열어줘

현대생물학에서 가장 흔히 하는 실험중의 하나가 외래 단백질을 세포에 발현해서 세포에 미치는 영향을 보는 것 등이다. 이런 짓거리를 하는데에는 여러가지 이유가 있겠지만 가령 야마낚아 아저씨가 iPS 셀을 만들때를 생각해보자. 즉  Oct4, Sox2, Klf-4, c-myc 이라는 4개의 전사인자를 분화된 체세포에서 과발현을 해보니까 이게 iPS 셀이 되버린다는 것을 발견한 것도 그 좋은 예일 것이다.

그렇다면 외래 단백질을 세포에서 어떻게 많이 만드냐. 가장 흔한 예로는 결국 해당 단백질을 코딩하는 재조합 DNA를 세포에 때려넣고, 이 외래 DNA가 전사되어 RNA를 만들고, 이것이 다시 번역되어 단백질을 만드는 과정을 기다리는 것이겠지? 대충 이렇게 세포내에 외래 DNA를 넣는 과정을 트랜스팩션 (Transfections)이라고 하고, 생물학 실험 해봈다 하는 사람이라면 최소한 한번쯤은 해봤을 일이다.

그런데 이렇게 일상적으로 DNA를 넣을 수 있는데 뭔 걱정? 세포의 종류에 따라서 트랜스펙션이 제대로 되지 않는 세포는 꽤 많이 존재한다. 이런 경우에는 렌티바이러스와 같은 바이러스 벡터를 이용하여 감염시키니까 문제가 없어라고 생각할수도 있다. 그러나 여튼 몇가지의 문제가 있을 수 있는데

– 난 바로 외래 단백질을 처리하자마자 만들고 싶은데 DNA-RNA-단백질 과정을 거치려면 시간이 걸리잖아

– 외래 DNA를 넣었다가 그게 세포 내로 융합되어 지놈 내에 들어가버리면 어쩔껴?

– “너네들 트랜스펙션 좀 작작해..트랜스펙션하는데 쓰는 시약사다가 랩 망하겠다” – 항상 돈에 쪼들리는 한 교수님

즉, 외래 DNA를 통해서 외래단백질을 만들수도 있지만, 어떤 경우에는 다른데서 만든 (여기서 진행되는 ‘단백질 정제의 십계명’ 을 따라서 정제된 ㅋㅋ) 단백질을 바로 세포에 때려넣어야 할 필요도 있을 것이다.

그런데 어떻게?

세포에 단백질을 때려넣는 방법

뭐 이전에도 세포에 단백질을 넣는 방법이 없었던 것은 아니다. 가령,

Screenshot 2015-04-24 16.02.16

난자와 같은 상대적으로 매우 큰 거대세포의 경우에는 투명대 (Zona pellucida) 라는 막으로 둘러싸여 있는 관계로 뭔가를 넣으려면 미세조작기 (micromanipulator) 와 바늘을 이용하여 DNA, RNA, Protein을 찔러넣을 수 있다. 이런 경우는 그냥 푹 찔러넣으면 된다. 난자가 아닌 체세포에서도 가능은 하다.

2015-04-24 16.04.16

미세조작기와 microinjector 는 대충 이렇게 생긴 기기이다. 본 연구소의 괴수생산장비를 막 노출시키면 안되는데…

일단 이런 장비가 있으면 단백질을 세포에 찔러넣을수는 있다. 그러나 (1) 장비가 좀 가격이 나가고 (2) 일일히 세포 하나하나에 여러개의 샘플을 찔러넣는 것은 매우 노동집약적인 일이고 (3) 난자와 같은 큰 세포에서는 숙련자의 경우 어렵지 않게 할 수 있지만 이에 비해 훨씬 크기가 작은 다른 세포에서는 기술적으로 쉽지 않다.

이렇게 물리적으로 외래단백질을 찔러넣는것은 가능은 하지만, 대개 한정적인 세포에서 한정적인 수량을 다룰때나 사용할 수 있는 일이므로 한계가 있다.

그렇다면 다른 방법은? 일반적으로 단백질의 경우 세포막에 가로막혀서 특별한 수용체라든지 등의 흡수기작이 없으면 세포안으로 들어갈 수가 없는데, 바이러스 유래의 일부 단백질은 그런거 무시하고 세포막을 투과할 수 있기도 하다. 이런 단백질을 조사해 보니 Cell Penentration Peptide (CPP) 라는 서열이 있다는 게 확인되었다.

Cell Penetration Peptide에 대해서는 여기를 참조하도록 하고..여튼 제일 잘 알려진 CPP로는 HIV에 존재하는  TAT이란 단백질에 존재하는 서열로써 GRKKRRQRRRPQ 이다.  즉 우리가 어떤 단백질을 세포내로 통과시키기 위해서는 이러한 CPP 서열과 원래의 단백질을 연결하여 재조합 단백질을 만들면 이 단백질은 CPP 서열의 도움에 의해 세포막을 뚫고 세포안으로 똭!

문제 해결이네요…오늘은 논문도 안 읽고 서론만 하고 끝내겠습니다. 나중에 또 만나염……

이 보고 싶겠지만 여기에도 문제가 있다. 일단 단백질에 따라서 CPP 를 붙여도 효율이 틀려질 수 있다는 문제가 있을 수 있고, 두번째 문제라면 (어쩌면 더 심각한 문제) 단백질에 요상한 시퀀스를 다는 것에 따라서 단백질의 성질 자체가 틀려질 수 있다는 상황 되겠다. 가령 단백질이 세포막을 통과해도 제대로 기능을 수행하기 위해서는 특정한 목적지, 즉 세포소기관이냐, 핵이냐, 세포막이냐, 미토콘드리아등으로 찾아가는 것이 필요한데, 많은 경우 이러한 ‘목적지’ 역시 단백질 내에 있는 특정한 아미노산 서열에 의해 결정된다. 가령 핵으로 들어갈 필요가 있는 단백질은 NLS, 즉 Nuclear Localization Sequence라는 서열을 가지고 있고, 미토콘드리아로 가야 하는 단백질은 미토콘드리아 타겟팅 시퀀스가 있어야 하고..그런데 여기에 CPP를 달아놓으면…운 좋으면 원하는 목적위치로 갈 수도 있지만 그렇지 않을 수도 있다. 게다가 단백질의 끝에 CPP를 달아놓는 것에 따라서 단백질의 활성에 영향을 미치는 경우도 있고..따라서 세포막을 뚫고가려면 단백질에 물리적으로 CPP를 달아야 하지만, 이렇게 달린 CPP가 단백질의 성질에 영향을 미칠수 있다…

뭐 그래서 이런저런 문제가 있다는 이야기이고 이러한 문제를 완전히 해결할 방법은 현재까지는 없었다. 그런데 아마도 이런 문제를 해결할지도 모르는 가능성이 바로 이 논문에서 제시되었다는 이야기. 어떻게?

우리가 첨 의도한 실험은 이게 아닌것 같은데..

여튼 논문을 처음 살펴보면 이런 그림이 나온다.

Screenshot 2015-04-24 17.22.52

요 사람들은 Cos7 세포라는 널리 사용되는 세포에 저 앞에도 잠시 이야기한 유명한 전사인자인 Oct4 단백질을 세포로 전달하기 위한 실험을 하고 있었다. 왜 요런 실험을 하려고 했는지에 대한 원래 목적은 알 수 없다. 그러나 이 논문의 책임저자인 Niels Geiisen 이라는 사람이 원래 줄기세포 관련 연구를 하는 사람이고 Oct4라는 단백질은 유명한 야마나카 인자중의 하나라는 것을 생각해보면 뭐 단백질 가지고 리프로그래밍 하는 시스템 구축? 뭐 이런 비슷한 연구를 시도하던 도중이 아니었나 생각이 든다.

여튼 이들은 Oct4에 transactivation domain인  VP16 이 퓨전된 단백질을 가지고 이 실험을 하고 있었다. C말단에는 아르기닌 11개로 구성된 기존에 알려진 CPP를 달아놓았고 N말단에는 단백질 정제를 위한 His-tag을 달았다. 아마 네거티브 콘트롤로 쓰기 위해서 C말단에 CPP가 없는 넘도 하나 만들었겠지? 그래서 아마 CPP가 들어간 넘은 세포 속으로 들어가서 Oct4 타겟 유전자를 활성화하고 그렇지 않은 넘은 안들어가고…와 같은 결과를 예상했을 것이다.Oct4 가 활성화된 것은 Oct4 결합부위가 있는 Luciferase 리포터 유전자를 이용하여 Luciferase 활성정도로 측정..

그런데..

Screenshot 2015-04-24 17.31.15

CPP (R11)가 들어간 넘이나 안들어간 넘이나 상관없이 Oct4 가 세포내로 쑥쑥들어가! 혹시 몰라서 His tag을 떼버린넘도 역시 마찬가지...예상하지 못한 결과에 아마도 실험한 사람은 잠시 멘붕에 빠졌거나, 아님 PI한테 까였을지도 모른다. “실험 똑바로해” 하는 이야기를 들었을지도…뭐 자세한 것은 내부사정이니까 알 바가 아니고, 그렇게 아마 반복실험을 해도 동일한 결과가 나옴..으익 이거 뭐임..

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아마 실험을 여러번 해도 비슷한 예상치 못한 결과가 나오지 않았을까..단백질도 새로 정제해 보고…그 이후에  정제된 단백질 안에 들어있는 ‘뭔가’ 가 영향을 미치는 것은 아닐까? 라는 생각을 해서 버퍼안에 들어있는 성분들을 하나씩 빼보면서 영향을 미치는지를 보았다. 그랬더니 두개의 성분이 영향을 미치는것이 확인되었다. NaCl 과 Non-detergent Sulfobetain 201 (NDSB-201) 이라는 단백질 수용성을 개선해주는 첨가물질.

그렇다면 이게 혹시 Oct4-VP16 에서만 그런것인가? 라고 생각하여 단백질이 들어갔는지 안 들어갔는지를 쉽게 알 수 있는 단백질을 하나 골라서 정확한 조건을 잡기 시작했다. 이때 사용한 단백질은 페니실린 등의 내성을 부여하고 흔히 실험실에서 많이 사용하는 항생제인 암피실린에 내성을 주는 단백질인 베타-락타메이즈

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그렇게 해서 NaCl의 농도, 즉 삼투압조건, 각각 다른 염, NDSB의 농도, 단백질의 농도등에 대해서 조건을 최적화하였다. 즉, 다른 단백질을 써도 세포안에 같은 조건에서 들어간다.

그런데 이렇게 삼투압이 높으면 단백질은 들어갈진 몰라도 세포에 뭔가 좀 해를 주지 않겠나? 예상대로 이런 조건에서는 세포의 성장이 억제되는 현상이 나타났다. 그래서 ‘단백질은 들어가면서도 세포에 넘 해를 주지 않는’ 첨가물질을 찾기위해서 여러가지 ‘보호물질’ 을 찾으려고 해서 결국 Glycerol+Glycine을 같이 첨가하면 단백질이 세포내로 들어가면서도 세포에 해를 최대한 덜 끼치는 것을 확인하였다.

Screenshot 2015-04-24 17.41.02

그래서 이걸 가지고 좀 뭔가 유용한 작업, 가령 유전자조작에 사용할 수 없을까 생각해서 LoxP 서열을 인지하여 자르는 Cre Recombinase 단백질을 마우스의 ES셀에 넣어보려고 하였다. 이때 사용된 마우스의 경우 마우스에 외부유전자를 발현할때 흔히 사용하는 Rosa26 locus에 GFP가 들어있는데, GFP 가 정상적으로는 발현이 되지 않지만, Cre가 작동하면 GFP의 발현을 막는 부분이 잘려나가서 발현이 되는 ES셀. 즉 Cre 단백질이 세포에 들어가면 ES셀에서 GFP가 발현이 되고, 즉 이런식으로 세포에 들어간 단백질이 핵까지 들어가서 DNA를 자를 수 있다는 증거가 되겠지?

Screenshot 2015-04-24 18.14.43

ES셀에서만 되나? 그래서 여러가지 Primary Cell에 대해서 테스트를 해봤다. Neural Stem Cell, Dendritic Cell, Glial Cell, MEF, Neuron…

Screenshot 2015-04-24 18.18.13

다덤벼. 테스트한 건 다된다. 물론 잘 안되는 것은 논문에 싣지 않았겠지만 그건 넘어가자

그렇다면 이것을 가능케 해주는 ‘마법의 화합물’ 이라고는 하지만 사실 흔히 많이 사용되는 화합물. 누군가도 단백질 결정만들때 첨가제로 사용해본적 있음. 도 여러가지 변이체가 있는데 이 구조와 활성과의 관계는 어떤가?

Fig3-EVO7

그렇다면 여기서, 과연 이 단백질은 어떤 기전으로 세포막을 뚫고가는가? “뭐여 세포막만 뚫고가면 되지 그런 걸 꼭 알아야해” 라고 생각하실 분이 있겠으나, 궁금하지 않은가? 전능하신 리뷰어님이 궁금하시대잖아 말이 많아

아마 단백질은 소분자물질과는 달리 생체막을 그냥 어영부영 뚫고가기에는 넘 분자량이 크기때문에 뭔가 특이적인 기전이 있지 않을까? 혹시 endocytosis? 뭐 그래서 여러가지 화합물을 쳐서 단백질의 세포막 돌파가 얼마나 저해되는지를 관찰하였다.

그러나 현재까지 알려진 endocytosis 관련기전을 저해하는 화합물은 효과 읍슴.

그렇다면? 바이러스 등의 큰 물질을 삼킬때 세포가 사용하는 기전으로 macropinocytosis 라는 게 있는데, 보시다시피 세포막의 일부의 형태가 바뀌어서 물질을 확 삼켜버리는 기전이다.

Screenshot 2015-04-24 18.35.42

이것을 저해하는 화합물인 EIPA나 DMA를 쳐보니 단백질이 들어가는 정도가 확 떨어져! 근데 macropinocytosis는 세포막 근처의 세포의 형태가 바뀌면서 물질을 먹어치우는 현상이지? 근데 이런 세포의 형태가 바뀌는데는 누군가의 완소 단백질인 액틴 필라멘트의 리모델링이 필요하지? 그래서 액틴필라멘트의 중합을 억제하는 두가지 화합물은 cytochalasin D 혹은 LatA를 쳐봐도 단백질 돌파가 안 일어납네다. 이런데도 끼는 오지랖이 넓은 액틴느님…액틴이 괜히 누군가의 완소 단백질이 아닌겁니다 후후후

여튼 마지막으로 요즘의 모든 논문은 기승전크리스퍼가 되는데, Cas9 단백질과 sgRNA RNA를 만든 RNA-Protein Complex를 이 테크닉 (NaCl+NDSB)으로 세포안에 넣어서 지놈 에디팅을 할 수 있는지를 보았다. 물론 최근에 몇몇 연구진에 의해서 이것을 Cationic Lipid (Transfection할때 쓰는) 와 섞어서, 혹은 sgRNA에 CPP를 달아서 세포안에 넣을 수 있는 것을 보였다. 그런데 Transfection 할때 쓰는 시약 비싸고, sgRNA에 CPP  달려면 귀찮죠?

Screenshot 2015-04-24 18.45.16

세포 안으로 잘 들어가고요, 예상대로 원하는 부분의 지노믹 DNA 퍽퍽 끊습니다! 이전에 개발된 Cationic lipid를 이용한 Cas9 단백질전달에 비교하면 어떻냐고? 훨 잘돼. (위 그림의 C 참조)

Principle of Limited Sloppiness

여튼 처음에 이런 것을 의도했는지는 잘 모르겠지만, 결과적으로 이 연구자들은 재조합 단백질을 매우 간단하고 값싼 조건을 이용하여 세포내에 매우 높은 효율로 때려넣는 방법을 개발하였다. 당장 여기서 보는 것처럼 Cre Recombinase혹은 CRISPR/Cas9과 융합하여 지놈에디팅에 이용될수도 있을 것이고, 재조합 단백질을 이미 가지고 있는 경우 이들을 손쉽게 세포안에 넣어서 세포를 pertubation 할 수 있다는 것은 매우 강력한 툴로 생각된다. 그전에 일단 다른 랩에서 재현이 되어야겠지? 이넘의 복붙녀 오모씨 때문에 이제 ‘획기적’ 이라고 설레발치던 논문은 쉽게 신용이 안가! 

여튼 꽤 높은 응용가능성을 가진 연구가 어떻게 의도치 않게 발견될 수 있는지를 잘 보여주는 또 하나의 예라고 할 수 있겠다.

한가지 재미있는 점이라면 좀 꼼꼼히 실험하는 사람이라면 단백질을 정제한 다음에 높은 농도의 NaCl 이나  NDSB-201같은것은 투석 등으로 제거하고 생리학적인 버퍼로 교체하여 첨가했을지도 모른다. 그러나 우연인지 필연인지 이 실험을 한 사람들은 조금은 엉성하게 His-tag 컬럼에서 나온 좀 빡센 조건의 단백질을 그대로 세포에 처리했고, 그것은 예상치 않은 효과를 보였다.

여튼 이 이야기를 들으면서 생각난 이야기가 있다. 모르긴 몰라도 이 결과, 즉 높은 NaCl 및 단백질을 안 엉기게 하려고 넣었을 첨가제인 NDSB-201 이 이런 효과를 낸다는 것을 발견한 것은 막스 델뷰릭이 말한 ‘Principle of Limited Sloppiness’ 의 좋은 예가 아닐까? 그렇다면 Principle of Limited Sloppiness란 무엇이냐면..

Screenshot 2015-04-24 18.58.13

갑자기 소환된 델뷰릭 옹

I”f you’re too sloppy, then you never get reproducible results, then you never get reproducible results, and then you never can draw any conclusions; but if you are just a little sloppy, then when you see something startling, (…) you nail it down (…). So I called it the “Principle of Limited Sloppiness”.

당연한 일이지만 아주 덤벙대는 사람은 실험이 됐다 안됐다 뒤죽박죽이 되서 재현성이 전혀 없을 것이고 당연히 아무런 결과를 못 얻을 것이다.  반면에 실험실에 보면 항상 기계처럼 균일한 결과를 뽑는 사람도 물론 있는데, 이런 경우에는  처음에 예상한 가설에 입각한 결과는 (실험이 예상대로 가는) 경우 얻을 수 있겠지만, 예상치 못한 발견을 하는 경우 역시 드물지도 모른다 

그러나, 대개는 꼼꼼하게 실험을 하는데, 가끔 덤벙거리는 사람이 있다고 하자. 그렇게 실험을 하다가 예상되지 못한 결과를 얻었다면? 그럴 경우에 어떻게 해야 하나? 아주 덤벙대서 실수를 많이 하는 사람은 워낙 여기저기서 틀릴 요소가 많기 때문에 뭐가 그런 예상되지 못한 결과를 낳는지 알기 힘들겠지만, ‘조금’ 덤벙거리는 사람은 이전의 실험과 현재의 실험이 뭐가 틀린지를 찾아낼 수 있고, 그 원인을 찾아내는 것이 중요한 과학적 발견의 지름길이라는 이야기.

물론 여기서 생각해야 할 것은

(1) 일단 아주 개판으로 일을 해서 실험이 절대 재현안되는 수준에서는 이 이야기 생각하지 말자. -.-;;;

(2) 그러나 아주 가끔 예상되지 않는 결과가 나온다면, 그게 바로 발견의 문턱인데, 이런 상황에서 어떻게 이것을 새로운 발견으로 이끌어나가느냐가 당신을 성공적인 과학자로 이끄나냐 아니냐의 갈림길이 된다 이런 이야기.

5 thoughts on “오늘의 논읽남 : 세포막을 여는 마법의 열쇠

  1. 한국어로 읽으니 너무 좋으네요~ 읽어보면 좋겠다고 생각하면서도 영어의 벽 때문에 (사실 귀찮아서.-_-;) 읽지 못하는 글들이 너무 많은데… 재미있게 보고 갑니다^^ 감사합니다!!

  2. 정말 잘 읽었습니다. 그런데 질문이 하나 있는데 NDSB-201이라고 하셨다가 밑에서는 NSDS-201이라고 쓰시고 이게 두 번 정도 반복되니 혹시 다른 것인지 아님 오타인지 궁금합니다. 구글링한 결과로 봤을 때는 오타인 듯 합니다만…..

  3. 어쩌다 생물학쪽에서 이제 막 일하게 된 한의사라
    정말 기초적인 질문일거 같은데
    이 논문은 in vitro 수준에서의 결과 같은데
    이런 식의 in vivo 실험도 가능할까요??

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