오늘의 논읽남 : 세포막을 여는 마법의 열쇠

오늘 읽어볼 논문은 다음 논문이 되겠다.

D’Astolfo et al., Efficient Intracellular Delivery of Native Proteins, Cell 2015

문을 열어줘

현대생물학에서 가장 흔히 하는 실험중의 하나가 외래 단백질을 세포에 발현해서 세포에 미치는 영향을 보는 것 등이다. 이런 짓거리를 하는데에는 여러가지 이유가 있겠지만 가령 야마낚아 아저씨가 iPS 셀을 만들때를 생각해보자. 즉  Oct4, Sox2, Klf-4, c-myc 이라는 4개의 전사인자를 분화된 체세포에서 과발현을 해보니까 이게 iPS 셀이 되버린다는 것을 발견한 것도 그 좋은 예일 것이다.

그렇다면 외래 단백질을 세포에서 어떻게 많이 만드냐. 가장 흔한 예로는 결국 해당 단백질을 코딩하는 재조합 DNA를 세포에 때려넣고, 이 외래 DNA가 전사되어 RNA를 만들고, 이것이 다시 번역되어 단백질을 만드는 과정을 기다리는 것이겠지? 대충 이렇게 세포내에 외래 DNA를 넣는 과정을 트랜스팩션 (Transfections)이라고 하고, 생물학 실험 해봈다 하는 사람이라면 최소한 한번쯤은 해봤을 일이다.

그런데 이렇게 일상적으로 DNA를 넣을 수 있는데 뭔 걱정? 세포의 종류에 따라서 트랜스펙션이 제대로 되지 않는 세포는 꽤 많이 존재한다. 이런 경우에는 렌티바이러스와 같은 바이러스 벡터를 이용하여 감염시키니까 문제가 없어라고 생각할수도 있다. 그러나 여튼 몇가지의 문제가 있을 수 있는데

– 난 바로 외래 단백질을 처리하자마자 만들고 싶은데 DNA-RNA-단백질 과정을 거치려면 시간이 걸리잖아

– 외래 DNA를 넣었다가 그게 세포 내로 융합되어 지놈 내에 들어가버리면 어쩔껴?

– “너네들 트랜스펙션 좀 작작해..트랜스펙션하는데 쓰는 시약사다가 랩 망하겠다” – 항상 돈에 쪼들리는 한 교수님

즉, 외래 DNA를 통해서 외래단백질을 만들수도 있지만, 어떤 경우에는 다른데서 만든 (여기서 진행되는 ‘단백질 정제의 십계명’ 을 따라서 정제된 ㅋㅋ) 단백질을 바로 세포에 때려넣어야 할 필요도 있을 것이다.

그런데 어떻게?

세포에 단백질을 때려넣는 방법

뭐 이전에도 세포에 단백질을 넣는 방법이 없었던 것은 아니다. 가령,

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난자와 같은 상대적으로 매우 큰 거대세포의 경우에는 투명대 (Zona pellucida) 라는 막으로 둘러싸여 있는 관계로 뭔가를 넣으려면 미세조작기 (micromanipulator) 와 바늘을 이용하여 DNA, RNA, Protein을 찔러넣을 수 있다. 이런 경우는 그냥 푹 찔러넣으면 된다. 난자가 아닌 체세포에서도 가능은 하다.

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미세조작기와 microinjector 는 대충 이렇게 생긴 기기이다. 본 연구소의 괴수생산장비를 막 노출시키면 안되는데…

일단 이런 장비가 있으면 단백질을 세포에 찔러넣을수는 있다. 그러나 (1) 장비가 좀 가격이 나가고 (2) 일일히 세포 하나하나에 여러개의 샘플을 찔러넣는 것은 매우 노동집약적인 일이고 (3) 난자와 같은 큰 세포에서는 숙련자의 경우 어렵지 않게 할 수 있지만 이에 비해 훨씬 크기가 작은 다른 세포에서는 기술적으로 쉽지 않다.

이렇게 물리적으로 외래단백질을 찔러넣는것은 가능은 하지만, 대개 한정적인 세포에서 한정적인 수량을 다룰때나 사용할 수 있는 일이므로 한계가 있다.

그렇다면 다른 방법은? 일반적으로 단백질의 경우 세포막에 가로막혀서 특별한 수용체라든지 등의 흡수기작이 없으면 세포안으로 들어갈 수가 없는데, 바이러스 유래의 일부 단백질은 그런거 무시하고 세포막을 투과할 수 있기도 하다. 이런 단백질을 조사해 보니 Cell Penentration Peptide (CPP) 라는 서열이 있다는 게 확인되었다.

Cell Penetration Peptide에 대해서는 여기를 참조하도록 하고..여튼 제일 잘 알려진 CPP로는 HIV에 존재하는  TAT이란 단백질에 존재하는 서열로써 GRKKRRQRRRPQ 이다.  즉 우리가 어떤 단백질을 세포내로 통과시키기 위해서는 이러한 CPP 서열과 원래의 단백질을 연결하여 재조합 단백질을 만들면 이 단백질은 CPP 서열의 도움에 의해 세포막을 뚫고 세포안으로 똭!

문제 해결이네요…오늘은 논문도 안 읽고 서론만 하고 끝내겠습니다. 나중에 또 만나염……

이 보고 싶겠지만 여기에도 문제가 있다. 일단 단백질에 따라서 CPP 를 붙여도 효율이 틀려질 수 있다는 문제가 있을 수 있고, 두번째 문제라면 (어쩌면 더 심각한 문제) 단백질에 요상한 시퀀스를 다는 것에 따라서 단백질의 성질 자체가 틀려질 수 있다는 상황 되겠다. 가령 단백질이 세포막을 통과해도 제대로 기능을 수행하기 위해서는 특정한 목적지, 즉 세포소기관이냐, 핵이냐, 세포막이냐, 미토콘드리아등으로 찾아가는 것이 필요한데, 많은 경우 이러한 ‘목적지’ 역시 단백질 내에 있는 특정한 아미노산 서열에 의해 결정된다. 가령 핵으로 들어갈 필요가 있는 단백질은 NLS, 즉 Nuclear Localization Sequence라는 서열을 가지고 있고, 미토콘드리아로 가야 하는 단백질은 미토콘드리아 타겟팅 시퀀스가 있어야 하고..그런데 여기에 CPP를 달아놓으면…운 좋으면 원하는 목적위치로 갈 수도 있지만 그렇지 않을 수도 있다. 게다가 단백질의 끝에 CPP를 달아놓는 것에 따라서 단백질의 활성에 영향을 미치는 경우도 있고..따라서 세포막을 뚫고가려면 단백질에 물리적으로 CPP를 달아야 하지만, 이렇게 달린 CPP가 단백질의 성질에 영향을 미칠수 있다…

뭐 그래서 이런저런 문제가 있다는 이야기이고 이러한 문제를 완전히 해결할 방법은 현재까지는 없었다. 그런데 아마도 이런 문제를 해결할지도 모르는 가능성이 바로 이 논문에서 제시되었다는 이야기. 어떻게?

우리가 첨 의도한 실험은 이게 아닌것 같은데..

여튼 논문을 처음 살펴보면 이런 그림이 나온다.

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요 사람들은 Cos7 세포라는 널리 사용되는 세포에 저 앞에도 잠시 이야기한 유명한 전사인자인 Oct4 단백질을 세포로 전달하기 위한 실험을 하고 있었다. 왜 요런 실험을 하려고 했는지에 대한 원래 목적은 알 수 없다. 그러나 이 논문의 책임저자인 Niels Geiisen 이라는 사람이 원래 줄기세포 관련 연구를 하는 사람이고 Oct4라는 단백질은 유명한 야마나카 인자중의 하나라는 것을 생각해보면 뭐 단백질 가지고 리프로그래밍 하는 시스템 구축? 뭐 이런 비슷한 연구를 시도하던 도중이 아니었나 생각이 든다.

여튼 이들은 Oct4에 transactivation domain인  VP16 이 퓨전된 단백질을 가지고 이 실험을 하고 있었다. C말단에는 아르기닌 11개로 구성된 기존에 알려진 CPP를 달아놓았고 N말단에는 단백질 정제를 위한 His-tag을 달았다. 아마 네거티브 콘트롤로 쓰기 위해서 C말단에 CPP가 없는 넘도 하나 만들었겠지? 그래서 아마 CPP가 들어간 넘은 세포 속으로 들어가서 Oct4 타겟 유전자를 활성화하고 그렇지 않은 넘은 안들어가고…와 같은 결과를 예상했을 것이다.Oct4 가 활성화된 것은 Oct4 결합부위가 있는 Luciferase 리포터 유전자를 이용하여 Luciferase 활성정도로 측정..

그런데..

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CPP (R11)가 들어간 넘이나 안들어간 넘이나 상관없이 Oct4 가 세포내로 쑥쑥들어가! 혹시 몰라서 His tag을 떼버린넘도 역시 마찬가지...예상하지 못한 결과에 아마도 실험한 사람은 잠시 멘붕에 빠졌거나, 아님 PI한테 까였을지도 모른다. “실험 똑바로해” 하는 이야기를 들었을지도…뭐 자세한 것은 내부사정이니까 알 바가 아니고, 그렇게 아마 반복실험을 해도 동일한 결과가 나옴..으익 이거 뭐임..

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아마 실험을 여러번 해도 비슷한 예상치 못한 결과가 나오지 않았을까..단백질도 새로 정제해 보고…그 이후에  정제된 단백질 안에 들어있는 ‘뭔가’ 가 영향을 미치는 것은 아닐까? 라는 생각을 해서 버퍼안에 들어있는 성분들을 하나씩 빼보면서 영향을 미치는지를 보았다. 그랬더니 두개의 성분이 영향을 미치는것이 확인되었다. NaCl 과 Non-detergent Sulfobetain 201 (NDSB-201) 이라는 단백질 수용성을 개선해주는 첨가물질.

그렇다면 이게 혹시 Oct4-VP16 에서만 그런것인가? 라고 생각하여 단백질이 들어갔는지 안 들어갔는지를 쉽게 알 수 있는 단백질을 하나 골라서 정확한 조건을 잡기 시작했다. 이때 사용한 단백질은 페니실린 등의 내성을 부여하고 흔히 실험실에서 많이 사용하는 항생제인 암피실린에 내성을 주는 단백질인 베타-락타메이즈

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그렇게 해서 NaCl의 농도, 즉 삼투압조건, 각각 다른 염, NDSB의 농도, 단백질의 농도등에 대해서 조건을 최적화하였다. 즉, 다른 단백질을 써도 세포안에 같은 조건에서 들어간다.

그런데 이렇게 삼투압이 높으면 단백질은 들어갈진 몰라도 세포에 뭔가 좀 해를 주지 않겠나? 예상대로 이런 조건에서는 세포의 성장이 억제되는 현상이 나타났다. 그래서 ‘단백질은 들어가면서도 세포에 넘 해를 주지 않는’ 첨가물질을 찾기위해서 여러가지 ‘보호물질’ 을 찾으려고 해서 결국 Glycerol+Glycine을 같이 첨가하면 단백질이 세포내로 들어가면서도 세포에 해를 최대한 덜 끼치는 것을 확인하였다.

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그래서 이걸 가지고 좀 뭔가 유용한 작업, 가령 유전자조작에 사용할 수 없을까 생각해서 LoxP 서열을 인지하여 자르는 Cre Recombinase 단백질을 마우스의 ES셀에 넣어보려고 하였다. 이때 사용된 마우스의 경우 마우스에 외부유전자를 발현할때 흔히 사용하는 Rosa26 locus에 GFP가 들어있는데, GFP 가 정상적으로는 발현이 되지 않지만, Cre가 작동하면 GFP의 발현을 막는 부분이 잘려나가서 발현이 되는 ES셀. 즉 Cre 단백질이 세포에 들어가면 ES셀에서 GFP가 발현이 되고, 즉 이런식으로 세포에 들어간 단백질이 핵까지 들어가서 DNA를 자를 수 있다는 증거가 되겠지?

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ES셀에서만 되나? 그래서 여러가지 Primary Cell에 대해서 테스트를 해봤다. Neural Stem Cell, Dendritic Cell, Glial Cell, MEF, Neuron…

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다덤벼. 테스트한 건 다된다. 물론 잘 안되는 것은 논문에 싣지 않았겠지만 그건 넘어가자

그렇다면 이것을 가능케 해주는 ‘마법의 화합물’ 이라고는 하지만 사실 흔히 많이 사용되는 화합물. 누군가도 단백질 결정만들때 첨가제로 사용해본적 있음. 도 여러가지 변이체가 있는데 이 구조와 활성과의 관계는 어떤가?

Fig3-EVO7

그렇다면 여기서, 과연 이 단백질은 어떤 기전으로 세포막을 뚫고가는가? “뭐여 세포막만 뚫고가면 되지 그런 걸 꼭 알아야해” 라고 생각하실 분이 있겠으나, 궁금하지 않은가? 전능하신 리뷰어님이 궁금하시대잖아 말이 많아

아마 단백질은 소분자물질과는 달리 생체막을 그냥 어영부영 뚫고가기에는 넘 분자량이 크기때문에 뭔가 특이적인 기전이 있지 않을까? 혹시 endocytosis? 뭐 그래서 여러가지 화합물을 쳐서 단백질의 세포막 돌파가 얼마나 저해되는지를 관찰하였다.

그러나 현재까지 알려진 endocytosis 관련기전을 저해하는 화합물은 효과 읍슴.

그렇다면? 바이러스 등의 큰 물질을 삼킬때 세포가 사용하는 기전으로 macropinocytosis 라는 게 있는데, 보시다시피 세포막의 일부의 형태가 바뀌어서 물질을 확 삼켜버리는 기전이다.

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이것을 저해하는 화합물인 EIPA나 DMA를 쳐보니 단백질이 들어가는 정도가 확 떨어져! 근데 macropinocytosis는 세포막 근처의 세포의 형태가 바뀌면서 물질을 먹어치우는 현상이지? 근데 이런 세포의 형태가 바뀌는데는 누군가의 완소 단백질인 액틴 필라멘트의 리모델링이 필요하지? 그래서 액틴필라멘트의 중합을 억제하는 두가지 화합물은 cytochalasin D 혹은 LatA를 쳐봐도 단백질 돌파가 안 일어납네다. 이런데도 끼는 오지랖이 넓은 액틴느님…액틴이 괜히 누군가의 완소 단백질이 아닌겁니다 후후후

여튼 마지막으로 요즘의 모든 논문은 기승전크리스퍼가 되는데, Cas9 단백질과 sgRNA RNA를 만든 RNA-Protein Complex를 이 테크닉 (NaCl+NDSB)으로 세포안에 넣어서 지놈 에디팅을 할 수 있는지를 보았다. 물론 최근에 몇몇 연구진에 의해서 이것을 Cationic Lipid (Transfection할때 쓰는) 와 섞어서, 혹은 sgRNA에 CPP를 달아서 세포안에 넣을 수 있는 것을 보였다. 그런데 Transfection 할때 쓰는 시약 비싸고, sgRNA에 CPP  달려면 귀찮죠?

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세포 안으로 잘 들어가고요, 예상대로 원하는 부분의 지노믹 DNA 퍽퍽 끊습니다! 이전에 개발된 Cationic lipid를 이용한 Cas9 단백질전달에 비교하면 어떻냐고? 훨 잘돼. (위 그림의 C 참조)

Principle of Limited Sloppiness

여튼 처음에 이런 것을 의도했는지는 잘 모르겠지만, 결과적으로 이 연구자들은 재조합 단백질을 매우 간단하고 값싼 조건을 이용하여 세포내에 매우 높은 효율로 때려넣는 방법을 개발하였다. 당장 여기서 보는 것처럼 Cre Recombinase혹은 CRISPR/Cas9과 융합하여 지놈에디팅에 이용될수도 있을 것이고, 재조합 단백질을 이미 가지고 있는 경우 이들을 손쉽게 세포안에 넣어서 세포를 pertubation 할 수 있다는 것은 매우 강력한 툴로 생각된다. 그전에 일단 다른 랩에서 재현이 되어야겠지? 이넘의 복붙녀 오모씨 때문에 이제 ‘획기적’ 이라고 설레발치던 논문은 쉽게 신용이 안가! 

여튼 꽤 높은 응용가능성을 가진 연구가 어떻게 의도치 않게 발견될 수 있는지를 잘 보여주는 또 하나의 예라고 할 수 있겠다.

한가지 재미있는 점이라면 좀 꼼꼼히 실험하는 사람이라면 단백질을 정제한 다음에 높은 농도의 NaCl 이나  NDSB-201같은것은 투석 등으로 제거하고 생리학적인 버퍼로 교체하여 첨가했을지도 모른다. 그러나 우연인지 필연인지 이 실험을 한 사람들은 조금은 엉성하게 His-tag 컬럼에서 나온 좀 빡센 조건의 단백질을 그대로 세포에 처리했고, 그것은 예상치 않은 효과를 보였다.

여튼 이 이야기를 들으면서 생각난 이야기가 있다. 모르긴 몰라도 이 결과, 즉 높은 NaCl 및 단백질을 안 엉기게 하려고 넣었을 첨가제인 NDSB-201 이 이런 효과를 낸다는 것을 발견한 것은 막스 델뷰릭이 말한 ‘Principle of Limited Sloppiness’ 의 좋은 예가 아닐까? 그렇다면 Principle of Limited Sloppiness란 무엇이냐면..

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갑자기 소환된 델뷰릭 옹

I”f you’re too sloppy, then you never get reproducible results, then you never get reproducible results, and then you never can draw any conclusions; but if you are just a little sloppy, then when you see something startling, (…) you nail it down (…). So I called it the “Principle of Limited Sloppiness”.

당연한 일이지만 아주 덤벙대는 사람은 실험이 됐다 안됐다 뒤죽박죽이 되서 재현성이 전혀 없을 것이고 당연히 아무런 결과를 못 얻을 것이다.  반면에 실험실에 보면 항상 기계처럼 균일한 결과를 뽑는 사람도 물론 있는데, 이런 경우에는  처음에 예상한 가설에 입각한 결과는 (실험이 예상대로 가는) 경우 얻을 수 있겠지만, 예상치 못한 발견을 하는 경우 역시 드물지도 모른다 

그러나, 대개는 꼼꼼하게 실험을 하는데, 가끔 덤벙거리는 사람이 있다고 하자. 그렇게 실험을 하다가 예상되지 못한 결과를 얻었다면? 그럴 경우에 어떻게 해야 하나? 아주 덤벙대서 실수를 많이 하는 사람은 워낙 여기저기서 틀릴 요소가 많기 때문에 뭐가 그런 예상되지 못한 결과를 낳는지 알기 힘들겠지만, ‘조금’ 덤벙거리는 사람은 이전의 실험과 현재의 실험이 뭐가 틀린지를 찾아낼 수 있고, 그 원인을 찾아내는 것이 중요한 과학적 발견의 지름길이라는 이야기.

물론 여기서 생각해야 할 것은

(1) 일단 아주 개판으로 일을 해서 실험이 절대 재현안되는 수준에서는 이 이야기 생각하지 말자. -.-;;;

(2) 그러나 아주 가끔 예상되지 않는 결과가 나온다면, 그게 바로 발견의 문턱인데, 이런 상황에서 어떻게 이것을 새로운 발견으로 이끌어나가느냐가 당신을 성공적인 과학자로 이끄나냐 아니냐의 갈림길이 된다 이런 이야기.

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연휴의 논읽남 : 정자와 난자가 만날 때

웬 19금스러운 제목인가 싶겠지만, 논읽남입니다. 논읽남 오늘 읽어볼 논문은 이거.

Bianchi et al, Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization,  Nature 2014

정자와 난자가 만날 때 

어느 성교육 시간

얼라 “샘..아기는 어떻게 생기죠?”

샘 (쭈빗쭈빗) “아빠의 정자와 엄마의 난자가 만나서 둘이 합쳐지면…”

물론 아빠 몸 속에 있는 아빠의 정자가 엄마 몸 속에 있을 엄마의 난자가 어떻게 같은 위치에 있게 되느냐에 대한 구체적인 기작에 대해서 설명하는 게 순서겠지만 ;;; 이 부분을 어떻게 얼라들에게 설명하실지는 논읽남이 어떻게 할 일은 아니라고 생각해염. 

그런데 아빠의 정자와 엄마의 난자만 딱 있는 상황 (예:세포외수정 In vitro fertillization) 이라면 모르겠지만 아빠의 정자가 엄마의 난자를 만나기까지는 수많은 다른 세포와 스쳐지나가게 된다. 하다못해 난자에 근접한 이후에도 문제인데, 난자는 흔히 보듯이 난자만 덜렁 있는 것이 아니라 cumulus cell 이라는 세포층에 둘러싸여져 있는데, 정자는 이를 비집고 들어가서 난자를 둘러싸고 있는 ‘투명대’ (Zona pellucida)라는 단백질층을 관통해서 난자와 세포융합을 실시한다. 다른 세포는 하나도 건드리지 않고 말이다어떻게?

게다가 일단 난자에 골인~ 한 정자는 다른 정자가 들어오지 못하도록 세포막과 Zona pellucida 단백질층을 변형시켜 뒤늦게 현장에 출몰한 정자들의 침입을 원천봉쇄한다.

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즉 정자는 마치 자석에 끌리듯 난자를 찾아가서, 난자의 투명대와 세포막을 뚫고 들어가서 난자에만 융합을 하게 된다. 게다가 이 융합의 경우는 종 특이적으로써, 당연히 쥐 정자는 사람 난자를 뚫고 들어가 수정을 할 수 없으며 그 반대도 마찬가지이다. 어떻게??

정자와 난자에는 타겟인 난자를 인식하는 열쇠와 열쇠구멍에 상응하는 것이 있으며, 좀 더 생화학적으로 이야기하자면 정자 표면에 있는 ‘어떤 생체분자가’ 난자의 세포막 위에 있는 ‘어떤 생체분자’ 과 특이적으로 결합을 해야 할 것이다. 대개 이 ‘생체분자’ 는 단백질이라고 생각하는게 보통이겠고..

그러면 그게 뭔데?

가 오늘의 논읽남 주제.

Izumo

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 한 10년 전에 정자 표면에 Izumo 라는 단백질이 존재하고, 이 단백질이 정자가 난자를 인지하는데 특이적인 ‘열쇠’ 로 작용하는 것이 확인되었다. 즉 이 유전자가 낙아웃된 쥐에서 나온 정자는 난자에 못 들어가고 당연히 불임.  난자가 저기 있는데 왜 합체를 못하니

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그렇다면 정자 표면 위에 존재하는 Izumo라는 단백질은 어떤 단백질인가? Immunogloblin하고 비슷하게 생긴 막 단백질.

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원래는 이 단백질이 기존에 난자표면에 존재하는 단백질이고, 이것이 없으면 불임이 유발되는 단백질인 CD9 이라는 단백질과 서로 상호관계인줄 알았다. 그러나 그렇지 않았다. 그렇다면 Izumo와 서로 작용하여 정자를 난자내로 들여보내는 단백질은 과연 무엇일까? 그게 약 10년 동안 찾아지지 않았다.

짚신의 짝을 찾는 방법

생체내에서의 많은 생명현상은 단백질간의 상호작용 (Protein-Protein Interaction) 에 의해서 일어나는 경우가 허다하고, 어떠한 단백질이 어떤 생명현상에 관여한다는 것이 발견되면, 다음 과제는 이 단백질과 상호작용을 하는 단백질이 어떤 것일까인지를 아는 것이다. 그렇다면 이런 단백질을 찾으려면 어떻게 해야하나?

흔히 단백질 상호작용을 찾을때 많이 사용되는 유전적인 방법으로는 “Yeast two-hybrid” 와 같은 시스템이 있고, 생화학적인 방법론으로는 GST pulldown 혹은 immunoprecipitation 등에 의해서 같이 딸려나오는 단백질을 프로테오믹스적인 방법으로 확인하여 찾는 등의 방법이 있을 수 있겠다. 그러나 본 논문에서는 이런 방법이 아닌 조금은 색다른 방법에 의해서 Imuzo 의 파트너를 찾게 되었다. 물론 해당 연구자들도 기존에 잘 알려진 방법들을 먼저 시도해 봤겠지. 그러나 그런게 안되니 10년동안 그 파트너를 발견하지 못한 것이겠고 ㅋㅋ  몇 가지 문제가 있었는데, 결합력이 많이 낮았고, 특히 Pulldown과 같은 방법으로 단백질을 분리하기에는 난자라는 샘플은 그닥 양이 충분하지 못해서 쿨럭..

여튼 이 사람들은 Izumo의 ectodomain만을 HEK293T 세포에서 발현하여 이것을 일종의 Probe로 사용하기로 하였다. 단, 단백질의 리셉터에 대한 결합력을 늘리기 위하여 단백질을 pentamer로 만드는 도메인과 fusion 한 단백질을 만들었고 뒤에 디텍션을 위한 FLAG tag, 정제를 위한 His tag을 달았다.

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그래서 이 단백질 프로브를 난자에  Immunostaining하듯 붙이고 Anti-FLAG 으로 염색해 보니 난자의 세포막에 슥~ izumo 단백질이 달라붙는 것을 알 수 있었다.

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그러나 HEK293T 세포 등과 같이 Izumo 리셉터 가 없는 세포에는 당연히 Izumo 단백질은 붙지 않는다.

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요런 성질을 이용하여 Izumo 단백질에 붙는 유전자를 클로닝하기 위해서 Expression cloning방법을 시도하였다.  이전에 80-90년대에 미지의 유전자를 찾을때는  많이 사용하던 방법이었는데지놈 시대에  넘의 Expression Cloning 이냐 생각하겠지만나중에 보면 알겠지만 시퀀스 호몰로지만으로 모든 유전자를 찾을 수는 없는거란다 얼라들야..

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마우스 난자 유래의 expression cDNA 라이브러리를 일단 대장균에 형질전환한후 한 플레이트에 약 100개 정도의 콜로니 (각각 다른 유전자가 들어있을) 가 나오게 깔고 이것을 360 플레이트를 깔았다. 그 다음에 플레이트에 있는 박테리아를 몽땅 합쳐서 플라스미드를  뽑음. 그러면 대충 랜덤하게 100개 정도씩의 클론이 합쳐진 풀이 360개 정도 나오겠지?  뭐 삼빡하게 360개 미니프랩 하면 됩니다 

그래서 약 360종류의 풀링된 플라스미드를 각각 HEK293 세포에 형질전환. 그 다음에 Izumo 단백질 깔고, Izumo 단백질이 멤브레인에 붙어있는지를 Immunostaining으로 디텍션.  그중 하나의 Pool에서 시그널이 나오는 넘이 잡힘.

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(약 100개 정도의 클론이 들어있을) 64번 Pool 을 다시 대장균에 형질전환해서 나오는 콜로니를 다 미니프랩 ㅋ

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그걸 다시 12개씩 썪어서 그룹별로 테스트.

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12개중 B2라는 넘이 당첨! 시퀀싱을 해보니

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기존에 folic acid receptor 로 알려졌던 유전자의 homolog로 db에 등록되어 있던 넘이다. (Folr4로 등록됨) 근데 시퀀스를 살펴보니 Folic acid 의 결합에 필요한 보존된 서열 중 몇개가 이가 빠져 있음. 그리고 folic acid 결합력을 조사해 보니,

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안붙음 ㅋ 이건 folic acid receptor 가 아님. 그래서 새로운 이름을 지었음. Juno. 이걸 보면서 느끼는 게 뭐 없으신지? 지놈 시퀀싱을 통해서 많은 유전자들의 기능이 단지 단백질 상동성만으로 무슨 단백질이라고 추측되곤 하는데 (생화학적인 분석도 없이) 이게 꼭 정확하지 않을수도 있다는 이야기지..

Juno

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여튼, 이 Juno라는 단백질에 대한 항체를 만들어 보니 난자의 세포막에 왕창 존재하는 것을 알 수 있었음.

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Juno 대한 항체를 처리하면 Izumo1 probe 난자의 막에 더이상 붙지 않음 Juno 항체가 Izumo1 Juno 상호작용을 블락한다는 이야기임

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정제된 Izumo와 Juno는 서로 상호작용을 (약하게) 하며(A) 시퀀스가 유사한 Folic acid receptor 들은 Izumo 와 상호작용을 하지 못하며 (B) 사람, 쥐, 돼지 등 포유류에서 Izumo와 Juno는 동일하게 상호작용을 한다는 이야기. 즉 포유류에서는 보존된 기작이라는 말씀

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그렇다면  단백질 간의 상호작용을 방해하면 난자와 정자가 수정되는 것을 방해할  있는가

마우스 정자와 난자 섞고 체외수정을 시도할때 Izumo Juno 항체를 넣어주면 수정 안됨

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낙아웃 쥐를 만들어 보니 Juno 유전자가 homozygote knockout   쥐는 새끼 못 낳음. 

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Juno (-/-) 쥐의 난자와 정자가 만나면 어떻게 되나 살펴보니 정자가 투명대는 통과하지만 투명대와 난자 사이의 공간인 위란강 (Perivitelline space) 에 정자가 몰려있음.  표면에 Juno 없는 난자는 정자가 뚫고들어갈  읍슴. 고지가 저기인데 왜 깃발을 못 꽂니

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못 뚫고 간다니까요

즉 Izumo 와 Juno의 상호작용은 정자가 수정후에 난자의 막을 뚫고들어가는 필수요소라는것이 입증되었다.  그런데 여기서 한가지. 수억마리의 정자가 난자로 비집고 들어가지만, 골인을 하는 넘은 딱 한마리. 일단 한마리가 골인을 한 다음에는 난자의 세포막에 ‘어떤’ 변화가 생겨서 더 이상 정자가 뚫고들어올수는 없게 된다. 그게 어떻게 일어나는가?  바로 여기서 밝혀진 Juno가 이 현상 (Cortical Reaction 이라고들 한다) 의 중심이 되는 단백질이라는 것이 밝혀졌다.

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 성숙된 난자 (Metaphase II) 에서는 Juno 세포막에 잔뜩 존재하지만수정 직후에 Juno 스르르 사라지며수정이 일어나면 완전히 세포막에서 사라지게 되고따라서 추가로 들어오는 정자의 침입을 원천봉쇄 

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EM 찍어보니까수정이 되면 Juno (쩜쩜으로 표시된 것들 세포막에서 스르르 덤프되서 방출된다는  확인됨 

 

그래서 어쩌라고

여기서 발견된 두개의 단백질의 상호작용은 꽤 의미가 있는데, 일단 해당 단백질이 수정과정에서 핵심적인 역할을 한다는 것이 알려졌으므로 불임 진단 등에서 꽤 유용하게 사용될 것이다. 단, 이 경우에는 단지 정자가 난자의 막을 뚫지 못한다는 것 뿐이므로 정자를 미세조작기로 찝어서 난자안에 찔러넣는 기술인 Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) 를 이용하면 정상적인 수정이 가능하므로 큰 문제는 되지 않을 것이다.

보다 더 재미있을 응용이라면 해당 단백질간의 상호작용을 방해하는 small molecule inhibitor 라든지 이런게 있다면 이것은 수정 과정을 직접적으로 막는 신개념 피임제제로 응용될 수도 있지 않을까. 물론 이를 위해서는 Juno – Izumo간의 단백질 결합구조를 규명하는 것도 필요할 것 같고…아니면 말고.

오카모토(주) 사장님이 이 논문을 싫어합니다

 

 

[흑역사] 그제 읽던 논읽남 : 문 “그 일본츠자가 한것이 그리 대단한거냐?” 답 “넹.”

업데이트 : 3월 10일, 이 논문의 공저자인 와카야마 테루히코가 다음과 같은 성명을 발표하였슴. 

이 사람은 오보카타 하루코가 제공한 세포를 이용하여  Chimeric Mouse를 제작하여 해당 세포가 만능성을 가진다는 것을 보이는 결정적인 증거를 제공했는데, 여러가지 문제점이 지적되고 있는 상황에서 자신이 사용한 세포가 제대로 된 STAP 프로토콜에 의해서 만들어진 것인지가 의문이 들었음. 따라서 자신이 가지고 있는 ‘STAP 줄기세포’ 를 다른 연구기관에 제공하여 분석을 하여 과연 이 세포가 제대로 된 세포인지를 확인하여 공표하겠다고 함.

그리고 Wall Street Journal 에 따르면 와카야마 테루히코는 논문의 철회를 요청하였다고.

상황은 조금 시간이 지나봐야 알 수 있겠지만, 이 불로그 주인도 이 논문의 내용에 대해서 신뢰를 가지고 있던 이유라면 와카야마 테루히코가 이 연구에 참여하였다는 것이 주된 이유일텐데, 와카야마 자신이 이렇게 의구심을 가지게 된 상황에서는 이 연구가 과연 제대로 된 연구인지에 대해서 의심을 하지 않을 수 밖에 없슴다.  

그리고 논문의 핵심 데이터를 관계없는 데이터로 복붙한 혐의 등이 드러나고 있는 관계로 해당 논문의 진위에 대해서도 심각한 의심을 갖게 되었슴다. 따라서 이 논문의 과학적 진위가 완전히 판가름난 것은 아니지만, 일단 본 포스팅도 따라서 흑역사화됩니다. 참고삼아, 문제점이 드러난 부분에 대해서는 붉은색으로 강조하여 업데이트할것입니다. 

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주의 : 여러분들은 지금 하일성 해설위원의 해설로 듣는 김연아 프리스케이팅 경기 중계를 듣고 있는것과 마찬가지라는거 아시죠? 전 줄기세포 업자아니므로 기술적인 설명및 구체적인 데이터 해석에 오류가 있을수 있슴다.  

자 오늘은 진짜 읽는다. 예습자료

먼저 메인 논문

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이 연구는 제일저자이자 책임저자인 오보카타씨가 와세다 대학의 박사과정일때 하버드의 Vacanti 라는 사람의 랩으로 교환연구생 식으로 일하러 가서 시작되었다. 이 Vacanti 라는 사람은 이전에 이걸로 유명해진 사람이다.

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소위 ‘Ear Mouse’라고 하는 요런 쥐를 만들어내서 사람들을 충격과 공포에 휩싸이게 하였으나, 사실 저 쥐가 얹고있는 것은 그저 귀 모양으로 연골조직을 면역거부반응이 없는 소위 ‘Nude Mouse’ 에 이식한 것이고 실제 귀는 아니다. 이런 논문으로 나오긴 했었다.

이 사람은 원래 마취과 의사이고 전공은 조직공학(Tissue Engineering)이다. 논문 목록 즉 전통적으로 줄기세포를 연구하는 사람으로 분류되는 사람은 아니라는 이야기. 그것도 그럴 것이 이사람이 가지고 있는 아이디어는 종래의 주류 줄기세포 / 발생학의 전통과는 좀 다른 방향에서 시작되었고, 추구하는 방향도 좀 틀리다는 이야기이다. 이 사람과 이 사람의 형인 Joseph Vacanti 라는 사람이 네임드로 있는 ‘Tissue Engineering’ 의 정의가 처음 규정된 것은 1993년이다.

참조

뭐 자세히 설명하긴 귀찮고, 이전부터 기존의 줄기세포를 연구하던 사람들이면 상당히 이단스럽게 여길 이야기들을 해 왔는데

– 물리적인 손상에 대해서 동물은 스스로 재생할 수 있는 능력이 있는데 (상처가 아물고 등등)

– 성인의 체내에는 다른 세포로 분화할 수 있는 줄기세포 비스무레한 것이 존재하고

– 이러한 것들이 새로운 세포로 분화되어 상처가 치유될 수 있슴다.

그러나 이러한 이야기들은 어디까지나 ‘소수파’ 로 남아 있었다. 대개의 반응 ‘이 의사양반 어디서 약을 팔어’ 그런데 이 랩에 와세다 대학 응용화학부 박사과정인 오보카타라는 사람이 연구생으로 2011년에 연수를 가게 되었다. 오보카타라는 사람 역시 생물학을 학부때 공부한 사람이 아닌, 화학베이스의 사람이라는 것을 기억하자. 선무당들이 생사람 아니 생쥐를 잡는현장이 요기잉네?

암튼 오보카타가 제일 처음 실험을 한 것은 다음의 가설이었다. “포유동물에서 외부 환경적 자극에 의해서 완전히 분화된 세포가 줄기세포와 비슷하게 될수는 없을까? 도룡뇽이 팔다리를 잘리면 재생을 하듯이..

웬만한 생물학 전공 교수한테 이런 프로젝트 하겠다고 하면 그 얼굴이 어떨지가 궁금해지는데 “레벨88 교수님이 재떨이던지기를 시전합니다”

이런 가설에 따라서 물리적인 자극, 즉 온도, 물리적인 스트레스, pH 등등등 온갖 개잡다한 조건으로 세포를 고문하기 시작하였다. 그렇다면 줄기세포가 아닌 분화된 세포가 줄기세포적인 성질을 가지게 되는지 아닌지는 어떻게 간단히 모니터링하는가? 이를 위해서 이전에 개발된 Oct4 프로모터에 GFP가 들어가 있어서 세포가 만능성 (Pluripotency) 을 가지게 되는지의 여부의 중요한 마커인 Oct4의 발현을 GFP 형광으로 모니터링할 수 있는 마우스를 이용하여 (문헌)

즉 이 마우스 잡아서 혈액의 구성성분을 만드는 지라(Spleen)에서 완전히 조혈세포로의 길을 걷도록 분화되어 더이상 줄기세포관련 마커를 발현하지 않는 체세포인 CD45+ 조혈모세포를 분리한 후 여기에 이런저러한 자극을 주었다.온도, 스트레스, pH..

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그런데 여기서 pH 5.7 에서 약 25분 처리를 하니 Oct4가 발현되어 GFP 시그널이 뜨는 현상이 발견되었다.

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일단 말보다 동영상 고고 

약 7일에 걸쳐서 세포를 배양하면서 사진을 찍어서 동영상을 만든것인데, 똥글똥글한 조혈모세포 중간에서 보면 알다시피 약 3일째부터 초록색 형광, 즉 줄기세포의 마커인 Oct4가 발현되는 너부적한 세포가 출현한다.

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죽은쎌과 GFP 형광발현되는 쎌을 숫자로 세서 정량화했더니

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약산성 용액으로 30분간 처리를 하고 배양한 후 첫날부터 3일까지는 전체적으로 살아있는 세포가 확 줄지만 죽어가는 세포중에서 Oct4 발현이 되기 시작한다, 즉 만능분화를 할 수 있다는 조짐을 스리슬쩍 보이는 것을 알수있다.

여기까지만 해도 상당히 놀라운 발견이지만, ‘풋, Oct4만 발현된다고 줄기세포로 볼수있겠음? 그리고 이건 Oct4 프로모터에 GFP 달린 컨스트럭트인데, endogenous 한 Oct4 나왔음?” 하는 이야기가 당연히 나올것이다.

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Oct4-GFP만 있는게 아니라 Oct4, Nanog, E-Cadherin 등의 마커들이 다 뜬다. 되는데요

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mRNA 레벨에서 ES 셀에서는 다 뜨지만 분화된 CD45+ 셀에서는 안뜨는 마커인 Nanog, Sox2 등이 저 초록색 괴세포에서 다 뜨는건 기본이며

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보통 ES셀에서는 항상 개빵빵하게 발현되는 Oct4, Nanog 등의 프로모터에는 거의 메틸레이션이 되어있지 않지만, 분화되면 메틸레이션되면서 장치가 정지합니다 하는게 보통인데 초록색 나오는 괴세포는 Oct4, Nanog프로모터의 메틸레이션이 다 풀려있었다. 반면 같이 컬쳐해서 똥글똥글하게 남아있던 넘들은 메틸레이션된 상태로 이런 유전자가 남아있었다.

그다음에는 이렇게 만능분화력을 가졌는지를 알아보는 차례로써 세포외에서 내배엽, 외배엽, 중배엽으로 분화하는지를 알아보는 차례.

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각각 발현해서 해당하는 세포에 상응하는 마커단백질을 잘 발현하는 것을 알수있다. 분화능력 OK.

그다음에는 이렇게 형성된 세포를 쥐에 찔러서 테라토마를 형성하는지를 보는 실험. 즉 실제생물 외가 아닌 실제 쥐 몸속에서도 분화능력이 있는지를 보는 실험으로써 줄기세포계에서는 거의 기본메뉴로 들어가는 것이다.

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아래 염색그림, 즉 각각의 외배엽, 중배엽, 내배엽에 해당하는 마커를 발현하는 그림이 바로 자신의 박사과정 논문때의 관계없는 결과 사진을 그대로 복붙한 그림으로 밝혀짐.

되는데요…Lv8벌레님 여기서 이러시면 곤란합니다

사실 야마나카 아저씨가 iPSC 를 처음 만들었을때는 아마 요정도의 실험만으로 해당 세포가 pluripotency를 가진다는 것이 입증된 ‘줄기세포’ 라는거라고 논문이 나갔다. 아마도 예상컨대 이정도의 데이터가 모였을때 (한두개의 데이터가 빠졌을수는 있겠지만) “우와 pH 만 바꾸는 것만으로 줄기세포 만들수 있ㅋ음’ 하고 중추신경 잡지에 논문을 던졌을거다. 그러나 아마도 이 단계에서 ‘…..못믿겠씀’ 정도의 이야기가 나와서 논문이 리젝이 되었겠지…

그런데 지금 이렇게 만든 세포가 과연 흔히 말하는 ‘줄기세포’ 인가에 대해서 몇가지 의문이 제기되기 시작하였다. 일반적으로 줄기세포의 골드스탠다드라고 알려진 배아줄기세포 (ES 세포라고 뒤에서부터 약칭) 의 특징을 요약하면

(1) 만능성 (pluripotency) 을 가진다. 즉 개체를 이루는 모든 세포로 분화할 수 있는 능력을 의미한다

(2) 자기재생능력 (Self-Renewal) 을 가진다. 즉 일단 분화된 세포가 몇대의 분열을 거치면 더이상 세포의 성질을 유지하지 못하는데, 줄기세포는 언제나 만능성을 가지며 자기복제를 유지할 수 있는 성질을 유지한다.

그런데 여기서 만들어진 ‘괴세포’ 는 만능성은 확실하지만 자기재생능력은 극히 제한된다는 묘한 특징을 보여주었다.  나갈때는 마음대로지만 있을때는 아니란다 이 이야기는 여기서 만들어진 ‘괴세포’ 가 배아줄기세포와 동일한 세포는 아니라는 것을 암시해준다. 그리고 ES 셀의 경우에는 세포를 개별적으로 분리해두면 자기복제하면서 디글디글 붙어자라는 소위 ‘콜로니’ 를 형성하는 것이 특이점인데 여기서 만들어진 ‘괴세포’ 는 그런 능력이 읍다.

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ES셀은 세포를 낱개로 분리하여 3일을 키우면 복제되며 디글거리는 콜로니 형성. 그러나 이 괴세포는 그런거 읍ㅋ다  즉 결론은 이 세포는 ES셀처럼 완벽한 만능분화능력을 지니나, 자기재생능력은 제대로 가지고 있지 않다는 이야기.

그다음에 알아본 의문은 “과연 조혈모세포만 되나? 다른세포는?” 에 대한 의문이다. 골수, 뇌, 간, 연골등등 온갖 잡세포들에 대해서 동일한 처리를 해보니

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즉 조직이나 세포에 따라서 효율은 차이가 있을지언정 결론은 항상 ‘되는데염?’

즉 pH 낮은솔루션에 푸욱 30분 동안 담궜다 7일키우면 다 Oct4-GFP 세포뜨고, 이런것들에게 줄기세포마커 5종세트 (Oct4, Nanog, Sox2, Klf4, Rex1) 발현조사해보니 다 나오고…즉 결론은 세포를 안가립니다….

아마 여기까지 데이터 뽑고 또 한번 논문 던졌을거다. 그러나 누군가 리뷰어가 ‘너네 세포가 하나의 완전한 개체가 되지 않는이상 몬믿게따.’ 딴지걸었을거다. 그리하여 쥐복제를 세계최초로 하고 핵이식에서는 신의손이라고 불리는 와카야마 테루히코라는 사람의 역할이 여기서 부각된다.

참고로 이사람이 최근에 한 일 중의 하나는 쥐 (마우스)를  복제하고 복제한걸또복제하고를 무려 25대에 걸쳐 할 수 있다는 것을 보인것이다.

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논문

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쥐복사장인

아마도 오보카타씨가 최초 연구를 시작한 곳은 미쿡이었지만, 이 연구를 완성하기 위해서는 이런 전문가들의 도움을 받아야 한다고 생각했기 때문에 학위를 마치고 리켄으로 포닥을 시작했을 것 같다.

여튼 여기서 보여준 것은 약산성 용액으로 처리하여 만들어진 셀을 마우스 배반포에 이식하여 과연 이 셀이 태어나는 개체에 기여할 수 있는지를 알아보는, 가히 줄기세포를 만들었다고 하면 이것을 보여주는 증거의 종지부격인 실험인 것이다.

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일줄로 요약하면 ‘되는데요?’ 이제 너의 패턴은 다 예측되었다

이사람들이 한 일은 이렇다.

– 일단 GFP가 전체적으로 발현되는 (처음에 쓰였던 Oct4-GFP와는 다르다) 세포로 그넘의 짱센세포 (이제 이름을 붙였다.  stimulus-triggered acquisition of pluripotency의 약자로 STAP Cell이라고 부르겠다) 를 만들고 이 세포덩어리를 칼로 찍 잘라 마우스의 배반포에 찔러넣었다. 일반적으로 형질전환생쥐를 만들때 하는 방법이다.

–  이때 정상적인 배반포와 tetraploid (4N) 로 만들어진 배반포에 동시에 찔러넣었다. teraploid 로 만들어진 배반포 유래의 세포는 염색체가 보통의 2배가 들어있는 상태이므로 배반포 단계까지는 발생이 가능하지만 착상된 이후에는 싸그리 다 죽어서 남아나지 않는다.

– 즉 정상적인 배반포 + 초록색 형광이 나는 STAP Cell 을 찔러넣은 경우에는 반포 유래의 셀 + STAP Cell 유래의 셀이 섞여있는 가 나오며

– tetraploid (4N) 배반포에 형광이 나는 쥐 STAP Cell을 찔러넣은 경우에는 4N 유래의 배반포유래의 셀은 착상후 다 죽고, 즉 STAP Cell 유래의 셀 (초록색 형광이나는) 로만 이루어진 쥐가 나온다.

형광 (즉 STAP Cell에서만 유래된 셀로 유래된 쥐) 이 나는 쥐의 심장박동

이제 끝이겠지? 했는데 아직도 더 보여줄게 남았다. 이건 미친짓이야 여기서 나가겠어 살다살다 정말 징한 인간들이다.

앞에서 만들어진 STAP 셀은 ES셀과는 다르게 자기재생 (Self-Renewal) 능력이 극히 떨어진다고 했다. 그리고 콜로니도 형성안하고. STAP 셀은 만들어진 조건에서 계속 키우면 3일만에 다 죽어버린단다. 그런데 이 배지에 기존에 ES셀을 키우는데 사용하는 배지로 배지를 바꾸니 STAP 셀은 마치 ES셀과 비슷한 셀로 짠~ 변신을 하는 것이 확인되었다. 이렇게 형성한 세포를 분리하면 마치 ES 셀과 같이 콜로니형성하고, 테라토마 형성하고, ES셀과 마찬가지로 4N 배반포에 찌르면 ES셀 유래의 chimeric mouse 만드는 식으로 마우스를 만들 수 있고.

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즉 ‘쳇, 만능성을 가졌다곤 라곤 하지만 진정한 줄기세포가 아니야 너님들의 셀은’ 하고 딴지를 걸었더니  ‘풋, 이걸로 레알 줄기세포를 만들면 되지‘ 하고 간단한 배지교환으로 완전히 ES셀과 비슷한 줄기세포를 만들어 버렸다. 뭐야 이넘들 무서워….그리고 이렇게 만들어진 줄기세포를 STAP-Stem Cell 로 명명하였다.

그렇다면 이렇게 만들어진 줄기세포는 기존의 ES 셀과 마찬가지로 다른 세포로 분화가 가능한가? 당근빠따구요…쥐를 통째로 만드는데 그게 안될까. 인증동영상으로 STAP 셀 만들고 이것을 STAP-Stem Cell 로 전환하고, 여기서 기존에 알려진 방법대로 심근세포로 전환했다. 세포가 쿵쿵 뛰는 ㅋㅋ

물론 여기에 소개되지 않은 보조데이터들도 더 있으나 지면이 부족해서 (보다는  내가 지쳐서) 암튼 보통 iPS 셀을 새롭게 만들었다에서 여러개의 논문에서 보여줄 내용을 한꺼번에 보여줘서 완벽한 만능성을 가지는 세포, 여기서 한번 더 변신하면 줄기세포가 되는 세포를 단순히 pH 좀 낮춰주는 것만으로 만들었다는 충격적인 결과를 보여준 셈이다.

그런데 이게 끝이 아니었다. ㄷㄷㄷ 펀치는 원투스트레이트가 제맛이죠 고만해 이 미친놈들아

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왜 또 별도의 논문이 나가는가? 이를 위해서는 지난번에 알아보았던 배아의 발생과정 그림을 다시 꺼내올필요가 있다. Screenshot 2014-02-03 22.32.00

난자와 정자가 만나서 Zygote 단계가 되면 이때는 Totipotency 하다고 한다. 만약 두 세포로 분열된 상태에서 이걸 두개로 쪼개면 그대로 각각의 배반포로 진행되어 완전히 동일한 유전정보를 지니는 일란성 쌍동이가 태어난다. 이렇게 8세포 전까지의 모든 세포는 동일하며, 이때의 세포는 이론적으로 세포 하나하나가 개체로 발생할 수 있는, 전능성 (Totipotency)을 지닌다고 한다. 그렇지만 일단 세포분열이 8세포기를 지나서 배반포를 형성하게 되면 배반포는 크게 2종류의 세포로 나뉘는데,

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1. 배반포의 외부를 이루는 trophoblast (이건 나중에 태반이 된다)

2, 내부 세포괴 (Inner Cell Mass)를 형성하는 embryoblast (태반을 제외한 모든 세포를 이룬다) 

즉 embryonic stem cell 을 만들었다고 하면 보통 내부세포괴에서 스템셀을 뽑아냈다라는 이야기이이다.

그런데 앞서 논문에서 여기서 만든 STAP 셀은 ES셀과는 좀 다르지만, ES셀과 비슷하게 만들어질수 있다라는 이야기를 했다. 

그리고 STAP 셀을 쥐의 blastocyst 에 찔러서 쥐를 만들어보니, 경천동지할 사건이 ‘또’ 일어났는데.

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일단 a 에서는 GFP를 발현하는 통상적인 ES셀을 배반포에 찔러서 chimeric mouse를 만들었다. 당연한 이야기지만 GFP 형광을 발현하는 ES셀을 ICM에 섞어주게 되니 나오는 마우스에서는 당연히 형광이 나오지만, 배반포를 구성하는 tropoblast 는 GFP 형광을 발현하지 않고, 찔러준 ES 셀은 trophoblast로 갈 수가 없으므로 태반에는 형광이 나오지 않는다.

그러나 STAP Cell 을 앞의 논문처럼 잘라서 배반포에 때려넣으니, 태반에 형광이 똭!

태반에 형광이 똭! 했다는 것의 의미를 이야기하면,

8세포기까지의 배아는 세포 하나하나가 전능성(Totipotency)을 가지고 있는데

요기서

– ICM이루는 ES Cell

– 배반포의 껍데기이며 나중에 태반이 되는 Trophoblast

이게 이렇게 새끼를 칠 수 있는데,

STAP 셀을 찔러넣으면

1. ES Cell도 되고,

2. Trophoblast도 되고.

STAP 셀은 ES셀과 Trophoblast가 동시에 될 수 있는, 일종의 전능성 (Totipotency)를 가지고 있는 세포라는 것이다. 앞서 논문에서 언급하였듯이 STAP 셀은 그 자체로만은 ES 셀과는 조금 성질이 틀리지만 ES셀과 거의 같은 성질을 가진 STAP-Stem Cell로 변환될 수 있다. 그렇다면 STAP 셀을 Trophoblast 로 변화시킬 수 있을까?

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결론을 말하면 된다. STAP 셀에 fgf4 라는 팩터를 처리하면 trophoblast 와 유사 세포가 되는데, trophoblast의 특징으로는 Oct4 가 발현이 안된다는 것. 그리고 cdx2 라는 단백질이 trophoblast의 마커이다. STAP 셀에 fgf4 처리하면 Oct4 발현은 줄어들고. 특이한 것은 STAP 셀에는 원래 cdx2 가 발현된다는 것.

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결론적으로 STAP 셀은 조건에 따라서 ES셀과 비슷한 성격을 가지는 세포로 변화할수도 있으며, trophoblast 의 성격을 가진 세포로도 변화할 수 있다는 것. 즉 이 세포는 기존에 알려진 단순한 ‘줄기세포’ 가 아닌 그보다 한단계 위의 분화능을 가진 세포라는 것. 마치 수정 직후의 배반포가 되기 전의 morula 단계의 배아세포 (개별 세포가 하나의 개체가 될 수 있는 전능성을 가진)와 비슷한 세포를 만들어 버린 것이다. 

그래서 어쩌라고?

그래서 결국 결론이 뭐냐?

1. 완전히 분화된 세포를 pH 5 정도의 약산성에 처리하는 것만으로 기존에 알려진 어떤 줄기세포보다도 분화능이 뛰어난, 거의 전능성을 가진 괴물세포가 창조되었다.

2. 그동안의 배아줄기세포, 체세포복제 줄기세포, iPSC 등 인간이 분리해 낸 어떤 줄기세포류보다도  한단계 위의 만능성을 지닌 세포이다.

3. 조건에 따라서 포유동물의 경우 단순히 외부적인 환경자극에 의해서 줄기세포가 생길수 있다는 것을 의미한다. 즉, 팔다리가 잘리면 이것이 복원되는 도룡뇽의 능력 중 일부는 쥐나 사람에게도 남아있을지 모른다라는 생물학적 상식을 초월하는 그런 이야기이다.

이것은 포유동물의 완전히 분화된 세포도 조건에 따라서 당근 (….) 수준의 전능성을 가질 수 있다라는 것을 암시하는 거의 충공깽스러운 연구이다. 세포가 전능성을 가질수 있다는게 무슨 의미냐면, 내 팔에서 채취한 피부세포를 이용하여 복제를 한다면, 기존에는 난자의 핵이식을 통한 체세포 핵이식 방법이 유일한 방법이었지만, 이젠 아예 이런 과정이 필요없는 복제가 가능할수도 있다는 이야기이다.  아직은 안된다. 안해봤으니까.ㅋㅋ

다르게 말하자면 그나마 난자 쥐어짜내기로 개복제는 했어요 복제 줄기세포는 못만들었지만으로 연명하시던 어떤 분은 이제 그 복제기술 자체가 동물복제에 있어서도 아무짝에도 쓸모없는 것이 되버렸다는 의미일수도 있다. 

(아님 최후의 기회라면 시베리아에서 캐온 맘모스 세포는 오랫동안의 스트레스때문에 이미 STAP 셀과 비슷한 상태로 되어있을지도 모른다. 걍 눈딱감고 코끼리 자궁에 넣어보는것도 차라리 나을수도 있다. 전능성을 가진 세포면 맘모스가 똭!)

그러나 다음의 한계를 가지고 있다.

1. 아직은 , 그것도 태어난지 2주밖에 안되는 쥐에서 유래된 세포에서만 성공하였다. 어린쥐는 되는데 어른쥐는 안된다

왜 어린쥐와 어른쥐의 세포가 틀린지도 매우 궁금하기 짝이 없다.

2. 사람 등등의 다른 동물에서 유래된 세포에서 되는지는 아직 모른다. (지금 누군가들은 열라게 하고 있을 것이다)

3. pH 를 낮추는 간단한 처리가 유전정보에 어떠한 영향을 미치는지, 도데체 무슨 일이 일어나서 이러한 리프로그래밍을 이루는지는 아직 모른다. 

이거 하나 밝힐때마다 오보카타씨는 중추신경 논문이 하나씩 떨어진다.

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4. 이걸 가지고 재생의학이 어떻게 될것이냐, 과연 쓸모가 있을것인지는 해보기 전에는 잘 모른다.

그러나 확실한 것은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16904174 츠자는  판도라의 상자를 지금 열어버린 것은 분명하다.

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아마 내 기억에 완전한 무명에서 이런 충공깽스러운 내용을 들고나온 과학자는 그닥 많이 못봤다.

그러면 이런 것을 물어볼 사람이 있을 것이다. “그 당시 황모씨가 줄기세포를 진짜로 만들었으면 그것과 이것을 비교하면?”

황모씨가 진짜로 줄기세포를 못 만든 게 이제와서는 한국의 천운이 되버렸다. 

난자를 기증하고, 난자를 쥐어짜내기하는 온갖 개삽질을 하면서 줄기세포를 하나 만들까 말까 하는 상황에서  난자따위는 전혀 필요없으며, 줄기세포의 골드스탠다드인 수정란 배아줄기세포보다도 짱센 킹왕짱 세포가 약산성 처리만으로 나오게 된 상황이 왔더라면 거의 국민적인 개맨붕에 빠졌을것이다.

지금까지 한 이야기가 넘 어렵습니까? 그러면 이런 비유는 어떨지. ㅋ 뭐 이것의 임팩트를 생물학에 전혀 관심이 없는 사람에게 비유한다면 대충 이런 소리다.

아이폰이 깨지거나 고장나면 어떻게 하나요?
애플케어를 아예 처음부터 가입하거나
돈내고 유상 리퍼를 받거나,
아니면 사설수리를 찾거나,
아니면 이베이에서 부품을 사서 분해서서 자가조립을 하거나..
뭐 이런 삽질을 하고있는 와중에

클*랑이나 뽐* 사이트에  ‘고장난 아이폰, 떨어져서 깨진 아이폰을 뜨뜻한 아랫목에 30분 이불덮어 놓아두면 리퍼, 아니 비니루도 안뜯은 케이스에 담긴 넘으로 재생되요‘ 하는 이야기를 들은 기분?

그래서 ‘와 유딩돋네ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ’ 했는데 속는셈 치고 아랫목에 이불덮어놔봤엌ㅋㅋ

그런데 이불을 들추니 박스도 안뜯은 아이퐁이 똭 놓여있어…뭐 이런수준의 이야기임.

이해되심?

뭐 차후의 변동과정은 그때그때 논읽남 하겠슴다.

오늘의 논읽남 : “Q : 그 일본츠자가 한 일이 그리 대단한거냐?” (전편)

오늘의 논읽남은 장안의 화제인 논문을 다루어보도록 하자.

Obokata et al., Stimulus-triggered fate conversion of somatic cells into pluripotency, Nature 2014

Obokata et al., Bidirectional developmental potential in reprogrammed cells with acquired pluripotency, Nature 2014

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뉴스에 많이 나오신 이 츠자 양반 논문 말이다. 과연 이렇게 뉴스로 떠들만큼 대단한 일인가?

“넹”. 제곧내라니깐요

물론 과학즈질만담블로그인 본 블로그에서는 오보카타 박사님의 독특하신 실험복 패션에 대해서 좀 떠들다가 지나갈수도 있을 것이다. 그러나 사안이 사안인 만큼 (본 연구소의 본 사명인 세계정복을 위한 괴수창조에도 영향을 받는다) 도데체 이 양반이 한 일이 어떤 의미를 가지고 있는지에 대해서 조금 뒤벼보도록 하자. ㅇㅋ? 그러나 본 블로그 주인장은 어디까지나 줄기세포 업자가 아닌 관계로, 여기서 다루는 내용의 깊이란 하일성이 해설하는 월드컵 축구경기의 전망과 비슷한 수준일 것이라는 것을 미리 전제에 깔아두고자 한다.

일단 줄기세포가 뭐냐에 대해서……2005년 겨울에 열심히 공부하셨다구요? 지금쯤 쿨타임 돌아왔습니다. 반납하셨을테니 잠깐만 알아보도록 합시다?

1. 한국인이면 제발 줄기세포 좀 응원공부합시다

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출처 : 위키피디아 (stem cell 치고 구글 이미지 검색하면 일빠로 나오는 그림)

우리는 “야 이 단세포같은 녀석들아” 하고 세포 하나짜리 생물을 개무시하곤 하지만 그러지 마라. 너네들도 옛날에는 세포 하나짜리였다. 즉 유전자 한쌍조차 아닌 달랑 n=23 개 DNA들고 만난 정자와 난자가 만나서 생긴 최초의 세포를 Zygote 라고 하는데, 여기서 우리를 이루고 있는 모든 세포가 만들어진 것이느니라.

세포가 한넘에서 두넘, 두넘에서 네넘, 네넘에서 여덟넘으로 이루어지는 과정이 수정후 며칠간 이루어지게 되는데, 이때까지의 세포 하나하나는 한넘이 완전한 개체를 이룰 수 있다고 한다. 뭐 업자용어로 전능성 (totipotency)을 가졌다고 카드라.

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그렇게 8개 세포기를 지난 배아는 이때부터 역변하기 시작하는데, 세포의 갈림길이 이루어지는게 바로 배반포 (Blastocyst) 단계이다. 이게 바로 그 황빠님들이 좋아하던 그 배반포다.

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출처는 말안해도 위키피댜래니깐

이때부터 세포는 크게 두가지 종류로 나뉘는데, 외부를 이루고 있는 세포를 trophoblast 라고 하며, 이는 나중에 태반을 이루는 성분이 된다. 내부에 있는 내세포괴 (Inner Cell Mass)가 진짜배기인데, 바!로! 줄기세포라는넘이 내세포괴에 있다는것이고, 이 내세포괴에 있는 줄기세포는 생물을 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진다.

그런데 왜 이게 중요하냐구? 사람은 어떤 의미에서 당근(…)이나 도룡뇽(-.-) 보다 조낸 열등한 존재인데, 우리가 사고로 팔다리를 잃었을 경우, 뭐 그럼 땡. 그런데 도룡룡느님은 잘린 팔을 재생하신다.

당근느님은 뿌리에서부터 통째로 당근을 재생해 내신다.

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그런데 만물의 영장이신 호모 싸피엔스느님은 이게 안된다! 즉, 앞에서 말한 배아단계, 즉 배반포가 되기전까지는 그게 가능하지만, 배반포가 생기고, 그 이후부터 게임컨티뉴를 누른 다음에는 리로딩이 안된다는 것이다! 그러니 매우 좋지 않은 곳에 총알이 지나간 심모 형님은  K.O. J. A 가 될수밖에 없는 것이고, 교통사고로 척수가 마비된 사람들은 영영 다시 일어설 수 없는 것이다. 당근보다, 도룡뇽보다 못한 우리 호모싸피엔스. 참 후졌죠?

당근보다, 도룡뇽보다도 열등한 호모사피엔스의 처지에 낙담하지 않고 “나의 호모싸피엔스는 그렇지 않아!” 를 외친 분들이 계셨다. 이들이 주목한 것이 발생과정에서 사람등의 포유동물도 어느 시점에서는 전능성 (totipotency)를 가진다는 것이었다. 그렇다면 배반포 단계에서 모든 세포로 발생할 수 있는 트랜스포머…아니 뭔가 뭐시기 짱센세포를 뽑아내면 이걸 가지고 사람도 매우 좋지 않은곳에 총알이 지나가도 이것을 되살릴 수 있지 않을까 하는 등등의 깜찍한 기대를 가지고 여러사람이 달라붙어서 연구를 하기 시작했다.

1980년대 초반에 쥐의 수정란에서 배아줄기세포 (Embryonic Stem Cell)을 뽑을 수 있다는 것을 처음 발견한 이후, 1998년, 위스콘신대학의 제임스 톰슨이라는 아저씨가 인간배아로부터 최초로 배아줄기세포를 뽑아서 배양할 수 있다는 것을 확인하였다.

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가운데가 줄기세포 콜로니.

그런데 여기서 문제가 해결된 것은 아니라는 게 함정. 세포를 이식을 하던 장기를 만들던 문제는, 사람은 자신의 유래의 세포가 아니면 남의 것으로 인지하는 면역반응을 가지고 있고, 이것을 해결하기 위해서는 결국 유전정보가 동일한 줄기세포가 있어야 한다는 말씀. 그런데 난자와 정자를 수정하여 만들어진 배아라면 결국 자신과는 다른 유전정보를 가질 수 밖에 없으며, 결국 수정란에서 유래된 배아줄기세포는 의학용으로는 그닥 쓸모가 없다라는 이야기이다.

이것을 극복하기 위해서 21세기 전반부에 일어난 일은, 체세포 핵이식 (Somatic Cell Nuclear Transfer) 에 의해서 복제배아를 만드려는 시도였다. 여기서 복제양 돌리까지 설명하긴 넘 귀찮다. ㅋ 걍 구글이미지 검색 신공 짜잔.

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즉, 체세포에서 핵치환을 한 다음 생성된 배반포를 자궁에 이식하면 복제동물을 만들 수 있지만, 이것을 배반포 단계에서 줄기세포가 들어있는 세포내괴 (Inner Cell Mass)를 취한후 이걸 배양, 참 쉽죠?

쉽긴 개뿔…….동물복제의 경우 일단 복제배반포까지 만든 다음 일단 자궁에 때려넣으면 대개는 죽지만, 어쩌다 한놈이 걸리면 태어날 수 있고, 그러면 ‘복제 완료’ 가 된다. 그러나 자궁이라는 것은 배아에게 최적의 환경이고, 우리는 세포외에서 배반포를 작살낸 다음, 여기서 만능성 (pluripotency) 을 지닌 줄기세포만을 배양해 내야 한다. 2004년-2005년 한국을 시끄럽게 한 그 모 사건이 이런 것을 시도하다가 성공하지 못한데서 발생한 일이다. 여튼..

그렇게 난자 가지고 낑낑거리다가 2006년에 일대 사건이 터지는데, 일본의 ‘야’ 모 아저씨 가 배아줄기세포에는 많이 발현되지만 체세포에서는 발현되지 않는 전사인자 (Transcription Factor) 를 체세포에 발현시키면 체세포를 줄기세포로 변형시킬 수 있지 않을까 하는 귀신 시나락 까먹는 (당시 기준으로) 깜찍한 아이디어를 가지고 결국 4개의 전사인자 (Oct4, Sox2, Klf4, Myc. 약칭 OSKM) 를 발현시키면 체세포를 줄기세포 비스무리한 만능성 (pluripotency)을 가진 세포 (induced Pluripotent Stem Cell) 로 변화시킬 수 있다는 논문을 발표하셨다.

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그래서 한번 운명이 결정되면 뒤로는 못돌린다고 알려진 세포의 운명을 개척하는 신시대가 열리게 된 거시다. 이후에 일어난 일들은 4개의 Factor 를 줄여보기, 바이러스 벡터 대신 RNA, Protein, miRNA 등등을 이용하여 만들어보기. 아니면 아예 줄기세포를 거치지 않고 다른 Cell Lineage로 점프하기, 화학물질을 이용하여 만들어보기 등등..한번 봇물이 터진 이후에 수많은 방법들이 쏟아져 나왔다.

뭐 근데 이런 내용은 굳이 본격즈질과학만담블로그를 안가도 알수 있는 내용, 즉 과학뉴스만 열심히 눈팅해도 다 아는 이라고 쓰고 안다고 착각한다고 읽는다내용 아닌가? 즉 실제 그 내면의 과학에 대한 알맹이는 없는 이야기라는 것이다. 이제 여기에 대해서 또 한타임 떠들고자 한다.

우리의 오보카타 박사님하의 업적은 언제 설명할거임?” 하는 오빠 (Dr. Obokata의 팬? 이므로 오 – 빠다. 황빠는 끝이고 오빠가 대세입니다. 고갱님)님들은 좀 기다리시죠.

2. 리프로그래밍 (Reprogramming)

그렇다면 야 아저씨가 4개의 전사인자를 넣어서 분화된 세포를 줄기세포 비스무레하게 돌리는 현상을 뭐라고 이야기하나? 이런 것을 리프로그래밍 (Reprogramming)이라고 한다. 여기 컴터 프로그래밍 짜본사람이라면 이 리프로그래밍의 개념을 좀 헷갈릴 수 있는데 기왕 프로그래밍 이야기 나왔으므로 리프로그래밍을 여기에 비유해서 설명하도록 한다. 난 컴맹이라고? 님 생물도 모르고 컴터도 모르고 대책읍슴다.

사람의 유전체에는 약 2만개 정도의 단백질이 있는데, 이것들 하나하나를 특정한 기능을 수행하는 모듈이라고 비유를 하자.  제대로 된 예라면 DNA는 일종의 펌웨어라고 생각하면 될 것이다. 여기서 중요한 것은 사람에게는 오만잡다한 세포가 다 있는데, 이들이 모두 하나의 펌웨어를 공유한다는 것이다. 즉 심근세포건, 뇌속의 뉴런이건, 총알이 스치면 영 좋지 않은 곳의 주 구성성분인 평활근 세포건, 피부세포건 모두 다 동일한 펌웨어를 쓴다. 단. 2만개의 펌웨어에 있는 모듈 중 자신들이 필요한 모듈 수천가지 정도만 적절히 메모리에 로딩해서 사용한다는 것이 틀리다. 뭐 고 잡스옹네 사과가게에서 나오는 제품들인 아이맥, 아이패드, 아이폰, 아이팟 등이 동일한 펌웨어를 공유하고 있다는 식으로 생각해 주면 적절한 비유랄까?

여기서 세포분화과정을 다시 한번. 구글 이미지 검색하면 대충 이런 그림 나온다.

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어디로 튈지 모르는 우리 줄기세포 느님은 2만개 중 상당수의 모듈이 그냥 켜져 있는 상태이다. 반면 특정한 계열의 세포에서만 필요한 모듈들은 꺼져 있는 상태이다. 세포분화라는 것은 결국 자신이 필요하지 않은 모듈은 램에서 삭제하고 (펌웨어에는 남아있다) 구동을 중지하고, 특정세포에서 필요한 모듈들을 샤샤샥 켜는 상태라고 할 수 있다. 사과가게 제품을 예로 든다고 하면, 줄기세포 느님은 아이퐁, 아이맥, 아이패드, 아이팟이 다 될 수 있는 일종의 준비상태인셈인데, 모듈 2만개 중 처음발생과정에 필요한 넘들 끄고, 아이퐁에 필요한 넘들만 샥샥 키면 아이퐁이 똭~ 아이패드에 필요한 모듈만 띄우면 아이패드로 똭~ 변신하는 그런 상태. 

이렇게 세포분화 과정을 거치게 되서 ‘완성품’ 세포가 되면 결국 그 세포가 필요로 하는 모듈만 딱 띄워져있는 상태가 된다라는 이야기이다.

그렇다면 리프로그래밍은 뭔가. 2만개의 모듈 중 대부분은 다 꺼져있고 필요한 모듈만 켜져있는 분화된 상태를 와장창 뒤집어서 2만개의 모듈이 거의 다 켜져있는 상태로 만드는 것이라고 이해하면 쉽다. 리프로그래밍이라니까 그냥 코드를 다시 쓴다 뭐 이런 개념으로 생각할런지 모르겠는데, 그냥 판을 뒤엎고 님이 쓴 코드 다 지워버림 ㅋㅋㅋㅋ 정도로 이해하는게 더 쉬울수도 있다. 

난 생물맹, 컴맹, 어쩌라고 하시는 분들을 위해서 다른 비유를 들어본다면,

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전능성을 가진 줄기세포는 산 정상에 있는 고무공. 자 중력에 의해서 조낸 아래로 공이 굴러떨어져 갑니다.한번 떨어지면 위로는 다시 못 올라갑니다. 그런데 한쪽 계곡으로 죽 빠져버리면 다른 계곡으로는 못 갑니다. 이게 세포분화.

그런데 이렇게 계곡 밑바닥에 빠져있는 고무공을 탱탱볼로 바꾼 다음에 조낸 세게 튕기니 산꼭대기까지 다시 올라갔다. 

이게 리프로그래밍.

야마나카의 4개의 팩터는 탱탱볼에 바운스 주는원동력

이제 이러한 것을 일으키는 실제적인 히스톤과 DNA 메틸레이션의 구체적인 화학적인 기작을….까지 하고 싶지만 여기까지 나가면 피를 토하고 쓰러질 분들도 있을것 같으므로 일단 생략. 이 블로그 잘 찾아보면 대충 써놓은거 있다.

3. 자 이제 논문을 읽어봅…

피곤한데 내일하죠. ㅋㅋㅋㅋㅋㅋ

오늘의 논읽남인데 논문은 내일 (어쩌면 모레) 읽어주는 초유의 사태가 일어났으니단 논문 두개 읽기 위한 예습이라고 생각하시고…내일은 진짜 읽는다.

결국 모레 읽었다. 요기 고고

근데 그냥 넘어가기 그러니 제 1저자의 랩 홈페이지 의 공지사항 소개

매스컴 들으삼

STAP 세포 연구는 겨우 출발선에 위치하고 있으며 세계에 발표해버린 이 순간부터 세계 모든 연구자들과의 경쟁이 빡시게 시작되씀. 지금이야말로 열라 빡시게 연구에 집중해야 한다고 긴장타고 있슴다.  

그런데 연구발표 기자회견 이후에 연구성과와는 관련없는 보도 열라 많이 나와서 연구하는데 조낸 지장이 많아염.  그리고 저 하고 가족의 개인정보에 대한것까지 취재한다고 디글거려서 빡치고 있고 아는사람, 친구, 동네사람 다 빡치고 있어서 열라 힘듬. 뭐 걍 소설 쓰시는 분도 있어서 그거 신경쓰느라 연구 못해먹겠음. 언론사 님들, 지금 이 연구가 조낸 중요한 시기인데, 너님들 때문에 연구못하면 책임질껴?

STAP 세포 연구의 발전을 위한 연구 활동을 긴 눈으로 지켜봐 주시길 부탁함다.

뭐 대충 이런 요지로 빡쳐서 공지 세웠다. 원문은 아래.

Jan. 31, 2014 報道関係者の皆様へのお願い

STAP細胞研究はやっとスタートラインに立てたところであり、世界に発表をしたこの瞬間から世界との競争も始まりました。今こそ更なる発展を目指し研究に集中すべき時であると感じております。

しかし、研究発表に関する記者会見以降、研究成果に関係のない報道が一人歩きしてしまい、研究活動に支障が出ている状況です。また、小保方本人やその親族のプライバシーに関わる取材が過熱し、お世話になってきた知人・友人をはじめ、近隣にお住いの方々にまでご迷惑が及び大変心苦しい毎日を送っております。真実でない報道もあり、その対応に翻弄され、研究を遂行することが困難な状況になってしまいました。報道関係の方々におかれましては、どうか今がSTAP細胞研究の今後の発展にとって非常に大事な時期であることをご理解いただけますよう、心よりお願い申し上げます。

STAP細胞研究の発展に向けた研究活動を長い目で見守っていただけますようよろしくお願いいたします。

와 이 언니 역시 멋있어 ㅋㅋㅋㅋ

오늘의 논읽남 : 그 약물은 영 좋지 않은 곳에 작용한다.

오늘은 다음과 같은 논문을 읽어보기로 한다.

Matzuk, MM et al., Small-Molecule Inhibition of BRDT for Male Contraception, Cell 2012

피임, 특히 남성피임의 방법에는 여러가지가 있지만 사실 완벽한 방법이 없는 게 사실. (없긴 왜 없어 고자되기 아니면 마법사되기)

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풍선은 완벽하지 않습니다 세계 인구중의 몇명이 찢어진 풍선 때문에 태어났을까?

여성피임약의 경우 대개 호르몬제제인 이유로 여러가지 부작용이 있다는 것은 널리 알려져 있는바, 안전하면서도 가역적인 (비가역적이고 완벽한 피임법이야 유사이래 알려져 왔었다 고자되기라고) 피임방법에 대한 관심은 매우 큰 것이 사실. 근데 그런게 잘 없었다.

그러나 재작년에 세포에 나온 이 논문은 큰 반향을 일으켰다. 즉 약물로 가역적인 남성피임이 가능할것이라는 동물실험 결과.

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과연 오카모토(주) 사장님은 밤잠을 제대로 주무실 수 있을 것인가? 여기서 과연 현재의 논문이 오카모토 사장님의 밤잠을 설치게 할 위협이 될지의 여부를 검증해본다. 본격 오카모도(주) 기획실 업무대행

여기서 제시한 결과는 대충 이런 결과이다.

1. Testis 특이적인 Bromodomain and extraterminal (BRDT) 라는 단백질을 저해하는 화학물질을 찾았고

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2. 약물과 단백질 복합체의 결정구조를 제시

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영 좋지 않은 곳에 달라붙은 화학물질

3. 이 화학물질을 마우스에 처리하니, 쥐가 생식능력을 잃었다

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쥐의 Fireball이 쭈그러들었닼ㅋㅋ

4. 그러나 처리 후 두 달뒤에는 회ㅋ복ㅋ

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처리군 쥐 “난 심영 고자가 아니야! 내새끼 좀 보소”

보다 자세한 것은 논문을 참조하시고 다음에 또 만나염…..

하면 좋겠지만 그러면 본격 즈질과학만담블로그로써의 의의가 반감된다. 그리고 지금쯤 밤잠 설치고 계실 오카모토(주) 사장님 이하 임직원 이하에게도 예의가 아니고. 따라서 본 논문의 연구배경 및 한계 등등에 대해서 약간 더 파보도록 하겠다.

1. 그럼 Bromodomain and extraterminal (BRDT)가 뭐냐? 

대개의 소분자 약물은 체내에 들어가서 뭔가의 생체고분자 (단백질 혹은 RNA 혹은 DNA. 그러나 대개는 단백질) 에 붙어서 그 기능을 못하게 하거나, 더 잘하게 하거나 둘 중의 하나의 역할을 수행한다. 즉 약물의 작용기전이 뭐요? 이런 질문은 그 약물이 어떻게 작용해서 그런 효과를 나타내느냐의 이야기인데..

이를 위해서는 일단 히스톤과 에피제네틱에 대한 이야기를 좀 해야겠다.

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생물시간에 졸지 않은 사람이라면 기억하고 있겠지만 유전정보인 DNA는 생체내에서 흔히 생각하듯 풀어놓은 실타래처럼 엉겨있는것이 아니라 히스톤이라는 단백질을 실감개삼아 요렇게 잘 감겨져 있다.

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즉 이렇게 실타래처럼 히스톤을 감아서 묶여있는 DNA를 어떻게 잘 풀어서 필요할때 DNA에 저장되어 있는 유전정보를 꺼내와서 RNA로 만들어 오는 것은 모든 생명현상을 조절하는 기본메커니즘 되겠다.

그런데 이렇게 크로마틴 형태로 디글디글 묶여있는 DNA 중에서 좀 더 쉽게 풀 수 있는 (Open chromatin) 형태로 있는 부분이 있고, 그렇지 않고 아주 빽빽하게 존재하는 (Close Chromatin) 부분이 있다. 즉 빽빽하게 묶여있는 부분에서 유전정보를 꺼내오는 것보다는 좀 더 느슨하게 묶여있는 부분에서 유전정보를 꺼내오는 게 더 쉽겠지. 따라서 활발하게 RNA로 발현되는 유전자들은 대개 오픈 크로마틴 형태로 존재하고 그렇지 않은 부분은 클로스드 크로마틴 영역으로 존재하곤 한다.

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그렇다면 어떤 부분이 헐겁게 되서 유전자 발현이 잘되게 만든지, 아니면 빽빽하게 크로마틴 구조를 형성하여 발현이 잘 안되게 만드는 것은 어떤 요인에 의해서 조절되는가? 주로 두 가지 요인이 있는데, DNA 염기에서의 변형 (주로 Cytosine의 메틸레이션) 과 히스톤의 꼬랑지에 있는 아미노산의 변형에 의해서 조절되곤 한다.

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꼬..꼬리를 보자!

다음은 히스톤 꼬리의 아미노산이 어떻게 변형되느냐에 따라서 어떤 일이 일어나는지를 간단히 요약한 표이다.

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인산화, 아세틸화, 메틸화, 유비퀴틴화 등 거의 알려진 모든 변형은 히스톤 꼬리에 일어나며, 이러한 히스톤 꼬리의 변형에 따라서 크로마틴의 구조가 변형되고, 따라서 DNA의 발현에 적합한 오픈크로마틴 형태로 되느냐, 아니면 발현이 억제되는 클로즈드 크로마틴 형태로 되느냐가 결정된다. 그런데 여기서 관심이 있는 것은 라이신에 아세틸그룹이 붙는 아세틸화이다.

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강한 양성기를 띄고 있는 라이신 잔기에 아세틸레이션이 되면 중화된다. DNA는 인산기가 있으므로 전체적으로 음성을 띄고 있는데 (인산염이 위험하다고 광고하는 커피회사, 그딴 헛소리를 씨부리다가 너네 DNA의 인산이 다 빠질수도 있다는 것에 주의할 것) 아세틸화가 되면 히스톤과의 결합력이 약화되는데, 일반적으로 히스톤 꼬랑지에 아세틸화가 되면 크로마틴이 풀리는 오픈 크로마틴 형태로 되는 경우가 많다. 오픈 크로마틴은 대개 유전자 발현을 유도하고..그러므로 히스톤 꼬랑지 아세틸화 – DNA가 히스톤에 잘 안붙어 – 크로마틴이 흐물흐물 – 유전자 발현이 업ㅋ 의 순서를 알아두면 좋다.

그렇다면 유전자 발현을 촉진하는 단백질 중에서는 이렇게 유전자 발현이 잘되는 오픈 크로마틴영역에서 히스톤 꼬랑지에 아세틸화가 되어있는 부분에 선택적으로 붙어서 크로마틴의 형태를 바꾼다즌지, RNA 전사를 개시한다든지 그런 기능을 가진 단백질들이 있는데, 이렇게 히스톤 꼬랑지의 아세틸화를 선택적으로 인지하는 도메인 (Domain) 이 발견되었는데 이것을 브로모도메인 (Bromodomain) 이라고 한다. 

즉 히스톤 꼬랑지에 뭔가를 다는 단백질을 Writer라고 하고, 이러한 달린 것을 없애는 것을 Eraser라고 한다면 브로모도메인은 현재의 히스톤 상태 (아세틸레이션이 되어있는지) 를 인지하기만 하는 Reader 라고 할 수 있을 것이다.

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그래서 생긴 것은, 대충 이렇다.

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히스톤 3의 36번째 라이신에 아세틸이 붙은 것과 철퍼덕 붙은 브로모도메인

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생물에는 이렇게 브로모도메인을 가지고 있는 단백질이 열라 많은데, 이들이 모두 동일한 일을 하지는 않지만, 어쨌든 공통적으로 가지고 있는 단백질 모듈인 브로모도메인을 통하여 아세틸화된 히스톤을 인지하여, 크로마틴을 추후로 변형시킨다든지, 전사를 촉진한다든지등등 여러가지 일을 한다.

그런데 고자되는 쥐새끼 이야기는 언제부터 하냐고..지금은 힘들다 잠시만 기다려달라

2. 요즘의 모든 연구는 암승전결

그런데 어쨌든 이 연구는 처음에 항암제를 개발해 볼까 하는 시도에서 시작되었다. 브로모도메인을 가진 단백질 중에서 Brd 어쩌구 하는 패밀리의 단백질이 있는데,

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N말단에 두개의 브로모도메인이 있고 뒤에 여러가지가 붙어있는 것들인데, 대개 이런 패밀리의 단백질들은 히스톤 꼬랑지에 아세틸레이션된 넘들을 인지하여 전사활성을 유도하는 것들이다.

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특히 셀사이클에서 M에서 G1 으로 넘어갈때 발현되는 유전자의 발현에 관여하고 등등등..따라서 몇 년전부터 이것을 어떻게 여차저차하면 항암타겟으로 쓸 수 있지 않을까 하는 연구들이 진행되어 왔었다. 그러던 와중 2010년에 이런 논문이 똭~ 하고 나왔다.

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이 논문은 Brd패밀리의 브로모도메인에 선택적으로 작용하는 JQ1 이라는 화학물질을 발견한 것으로 시작된다.

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이 화학물질은 Brd4에 철퍼덕 잘 달라붙으며 (기존에 알려진 다른 화합물이 microM 단위의 Kd 였는데 이것은 50 nM 수준의 Kd)Screenshot 2014-01-20 21.41.43

타겟인 BRD4에 철퍼덕 달라붙어!

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모델쥐에서 약발이 들어! 약찌른 쥐가 암조직이 줄어들고 오래살아.

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이 JQ1 이라는 케미컬을 가지고 좀 더 뒤벼봤는데, 유명한 oncogene의 하나인 (그리고 Mr. Ya의 OSKM중의 하나이기도 한) c-Myc의 발현을 억제하고, 따라서 c-Myc에 의해서 발현이 증가되는 방대한 유전자들의 발현을 억제한다는 것이 발견되었다.

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그래서?

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그래, 항암제는 그렇다치고, 쥐새끼 고자되는 이야기는 언제할거야? 자 지금부터입니다.

3. 본격 암승전고자 이야기

그렇다면 어떻게 항암제에서 쥐 심영만들기 이야기가 진행되게 되었는가? 그 자세한 내막은 솔직히 외부인인 본인이 알수가 없으나 (약을 맞은 쥐의 fireball을 우연히 검사해 봤더니 fireball이 작아졌어~ 우와 신기하네? 가 그 계기일수도 있을 것이나 그 진실은 알수없음) 논문에서 밝힌 것에 따르면 다음의 선행 연구에 주목했다고 한다.

1. 포유류에는 BRD1,2,3,4 및 Fireball(…) 에만 특이적으로 발현되는 BRDT라는 isoform이 있고, 다음의 시퀀스 비교에서 보다시피 아미노산 서열로 보면 다 거기서 거기. (즉 BRD4에 붙는 화학물질이라면 BRDT에도 붙을 것이라는 이야기)

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2. BRD 패밀리의 기능을 연구하기 위해서 낙아웃 마우스를 만들려는 노력을 했었는데 다들 안만들어져! 그런데 유일하게 만들어진 넘이 BRDT1. 그런데 이 낙아웃 마우스들이 사내구실을 못해! Fireball 이 기형이고 정자가 기형

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3. 2010년에 정자기형 등으로 불임인 172명의 사람들을 조사해 본 결과 일부의 사람들에게서 BRDT 유전자내에 있는 SNP이 association이 있는 것이 발견됨.

즉, BRDT가 없으면 쥐가 불임 – 근데 우리는 BRDT와 거의 비슷한 단백질에 붙어서 이를 저해하는 화학물질 (JQ1) 이 있잖아 – 이걸 쥐에 쳐보면? 그래서 이 연구가 시작되었다. (공식적인 스토리는 적어도 그렇다)

 

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그래서 이전에는 항암제로 열나게 선전하던 JQ1 이라는 케미컬을 가지고 BRDT에 붙여봤다. 당근 잘붙지. 아미노산 차이도 거의 없구만..

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이번에는 BRDT와의 구조를 봤다. 당연히 이전 BRD4 와 거의 동일하게 잘 붙지. 여기서 D, E 의 노란색 그림은 BRDT의 원래의 파트너인 아세틸레이션된 히스톤유래 펩타이드. 히스톤보다 더 잘 낑겨들어가는 것을 볼 수 있다.

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이제부터 본격 쥐 고자되는 이야기. 태어난지 9주령된 쥐에 3주 동안 쥐에게 매일 50mg/Kg, 즉 Kg 당 50mg, 쥐가 대충 50g 이라고 치면 하루에 2.5mg의 약물을 매일 찌르니 B의 왼쪽처럼 Fireball이 쭈그러들었음 ;;;; 볼륨으로 75% 감소. 정자숫자, 정자의 이동성도 극히 감소. 그렇지만 주목할 것은 성호르몬 (테스토스테론 등) 은 영향을 받지 않음. (K,L,M)

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겉보기로 Fireball 크기만 줄어든 게 아니라 내부도 부실. 제대로 정자가 만들어지지 않고있음.

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생식세포 형성에 관련된다가 알려져 있는 핵심유전자의 상당수의 발현이 왕창 억제됨. BRD4 를 억제할 때와 마찬가지로 BRDT도 Germ Cell 특이적인 발달과정에서 관여하는 유전자의 발현을 억제하는듯.

마지막으로 본 것은, ‘그러면 이렇게 약물처리하면 고자되는데 그럼 약을 끊으면 되돌아옴?’ 의 여부임. 뭐 사실 비가역적으로 사내구실을 못하게 한다면야 굳이 이런 화학약물적인 방법이 아닌 더 좋은 방법이 있습죠. 심영선생님 그렇죠?

결론을 1줄로 말하면 “약끊으면 부활입니다”

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쥐를 일단 합방시킨 다음에 두달 동안은 약을 계속 침. 그리고 새끼낳는 여부를 조사. 약 끊은 다음까지는 새끼를 못 남. 그러나 그 다음달부터는 새끼 생산개시~ 쪼그라들었던 Fireball의 크기도 두 달내에 원상복귀. 내부도 건전하다고! (I, J). K패널은 약쳤다가 끊은쥐가 낳은 새끼. 영 좋지 않은 곳을 약이 스쳤지만 이젠 괜찮습니다!

즉 약 끊은 후 두달 이후에는 정상적인 생식력이 복구된다는 이야기.

4. (주) 오카모토의 운명은?

자, 그래서 이제 ㅋㄷ계의 지존 (주) 오카모토는 부실기업 되는건가? 개인적인 판단으로는 이건 아직은 많이 오버. 이렇게 판단하는 근거는 여러가지가 있는데,

– 지금의 JQ1 이라는 화학물질은 아직 전임상 단계를 못 벗어난 단계. 즉 안전성과 효능이 판단되기에는 아직 멀었다. 그리고 대개의 후보물질들이 임상 1,2,3을 진행하면서 엎어지는 것을 생각해 본다면 향후 10년 정도는 두고봐야 하지 않을까.

– 그리고 JQ1 이라는 화합물이 워낙 많은 유전자의 발현에 영향을 주는 물질이라는 것을 감안할 때 상당한 Side Effect 가 있을 것임은 능히 예상된다. 만약 항암제라면 어느정도의 Side Effect 가 용인될 수 있을수도 있지만 (어차피 죽기 아니면 까무러치기의 상황이므로 설령 ‘고자되기’ 를 감수할 암환자도 충분히 있겠지만) 피임의 목적으로 있을 수 있는 Side Effect 를 얼마나 감수할 수 있을까?

– 게다가 (주) 오카모토의 주력제품은 단순히 피임만을 위한 것이 아니랍니다. 님 성병예방 무시 쩌네염.

자 그래서, 저의 결론은 (주) 오카모토 주주 및 경영진 여러분들은 당분간 걱정 안하셔도 되겠습니다. 그렇지만 이것을 시발점으로 하여 남성피임을 유도하는 약제의 개발이 폭발적으로 일어날지 누가 알겠슴…

“이런 것을 연구해봐야 밥이 나오냐 쌀이 나오냐” 하던 연구의 말로 (후편)

전편 링크

4. 2010. 그래서 미생물도 한번 감기가 걸리면 그 이후에는 잘 안걸리는 건 알겠는데, So what?

미생물의 적응면역이라는 신기한 토픽이 모 럭숴~리 저널에 한번 뜬 이후에 꽤 많은 덕후관련분야 학자, 혹은 꼭 관련분야가 아니었던 학자들의 관심을 끌게 되었다. 주로 이전까지는 미생물을 연구하던 분자생물학자/분자유전학자들이 주로 관심을 가졌다면 이제는 생화학자/구조생물학자 등 개별 단백질의 기능을 연구하는 사람들 역시 이 희한한 현상에 관심을 갖게 되었다고나 할까. 유전학자들이 대충 깨각깨작 그러놓은 그림을 실제 화학반응과 분자구조로 구체화하는 것은 언제나 불쌍한 생화학자와 구조생물학자의 몫. 

어쩄든 요쿠르트 회사의 하라는 연구는 안하고 엉뚱한 연구를 하던 연구자 2은 그동안의 연구결과들을 종합하여 다음과 같은 리뷰를 쓰게 되었다.

1. 파지가 박테리아 안으로 자기 DNA 를 찔러넣어! 왼손으로 DNA를 잘 파지했다 세균안으로 잘 투척~

2. 그러면 박테리아 세포내의 CAS 단백질 컴플렉스가 ‘어딜 감히?” 하고 파지 디엔에이에 척~ 붙어서 슥삭슥삭..

3. 일단 잘라놓은 넘이 나중에 또 들어오면 어쩌지? 지놈안에 붙여놓자. 나의 지놈은 포스트잇20bp 단위로 잘라서 차곡차곡 여태까지 들어오려고 했던 넘들것과 잘 모아두어용. 책갈피로 잘 구분해 두고 (이 책갈피가 바로 CRISPR에 나오는 Repeat)

4. DNA에 들어있는 ‘파지 DNA 조각모음’ 은 RNA 로 카피되고, 이건 잘 잘라서 crRNA라는 조각이 되고, 이것은 cas9 라는 단백질과 붙어서 또 Phage가 들어오는지 잘 감시~

5. 한번 들어왔던 놈이 들어오면 crRNA 와 붙는지 보고, 붙으면 와락~ 하고 잘라버림. 들어갈 땐 마음대로지만 나갈땐 아니란다

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적색으로 된 번호가 위의 설명에 해당하는 스텝.

물론 이러한 그림에 해당하는 단백질들이 어떻게 생겼는지, 어떻게 촉매작용을 수행하는지는 생화학자, 구조생물학자 너님들이 하셈~ 뭐 어쨌든 지금 현재까지도 ‘참 신기한 일이 다 있네~ 근데 왜 이런데 국민의 혈세를 낭비하지? 이런 것을 하면 쌀이 나오냐, 밥이 나오냐…’ 하던 사람이 있었을지도. 그러나 이미 이 시점에서도 내공이 높은 덕후학자들은 이 껀을 좀 뒤비면 뭔가 쩐이 될만한 게 나오리라는 낌새를 채고 있었다.

5. 2012. Programmable Restriction Enzyme

이렇게 요구르트 가이 2명이 던진 떡밥을 문 구조생물학자 중 한명이 버클리에 사는 제니라는 눈화였다. 제니 눈화의 전공이 원래 RNA를 쓱삭쓱삭 자르는 효소들이 어떻게 생겨먹었냐거든. 여러가지 일을 했지만 이전에 한 일은 진핵생물에 있는 어떤 쬐끄만 알엔에이를 짜르는 효소의 구조를 밝힌 것 등등. 어쨌든 저 업계에서는 좀 네임드라고 알아주는 양반이라고 생각하면 된다.

첫번쨰로 한 일은 CRISPR에 코딩되어 있는 바이러스 RNA 쪼가리들이 어떻게 각각 잘라지는지를 본 일.

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CRISPR가 일단 RNA 형태로 전사된 다음, CRISPR와 같이 따라다니는 유전자 중 CSR4 라는 넘이 리핏으로 구분된 스페이서 (파지 DNA 쪼가리) 를 슥슥 자르는데,

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리핏 부위의 stem-loop를 인식해서 자른다는 것을 밝혔다.

다음 스텝은 이렇게 만들어진 crRNA가 어떻게 파지 DNA를 자르느냐인데, 2012년 매우 결정적인 단서가 되는 연구를 스웨덴의 그룹과 공동으로 역시 모 과학 주간지에 발표하였다. 

1. 파지의 DNA 를 자르려면 3가지가 필요하다. 즉 파지 DNA 시퀀스와 동일한 crRNA + 실제 DNA를 자르게 하는 단백질인 cas9 + crRNA 와 cas9을 연결하는 tracrRNA

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2. 이 3가지를 넣으니 시험관 내에서 특정한 DNA를 자를 수 있어! 즉 CRISPR 시스템이 CRISPR에 들어있는 DNA 정보를 RNA로 변환한다음, 이것을 이용하여 파지의 DNA를 자를 수 있다는 것을 입증한 셈이다.

3. crRNA와 tracrRNA를 이어도 DNA가 잘라져! 그 이야기는 단백질인 cas9과 실제로 자를 서열의 DNA에 상응하는 RNA정보인 sgRNA 이 두가지만 있으면 DNA를 자를 수 있는 단백질 + RNA 하이브리드가 생기는 셈이다.

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그런데 여기서 중요한 포인트. 그렇다면 파지 DNA만 잘릴까? 즉 sgRNA에서 target과 상동성이 있는 시퀀스만 바꿔주면 sgRNA의 서열에 상응하는 어떤 DNA 만 자를 수 있다는 것을 확인하였다. 즉 이들은 여기서 RNA 서열만 바꾸어주면 자를 시퀀스를 결정해주는 ‘Programmable Restriction Enzyme’ 을 만든 것이다.

분자생물학에 약간의 지식이 있는 업자분들이라면 이게 무슨 의미인지 아실거다. 기존의 ‘유전자 재조합 기술’ 에 사용되던 제한효소는 대개 6bp, 길어봐야 8bp 정도의 서열을 인식하는 효소였고, 어떤 서열을 인식하는지는 고정되어 있었다. 그러나 이제 약 20bp 정도의 시퀀스를 인지하여 정확하게 자를 수 있게 된 것이다.

‘그게 어쨌다고?’ 생각하는 분들을 위해서 빨리 다음으로 넘어가자. ㅋ

6.2013. 고등생물의 지놈을 사각사각~

사실 유전자 재조합 기술이 나온지는 1970년대이긴 하지만, 이것을 쉽게 비유하자면 수백만 권의 책이 꽂혀있는 도서관에서 책 하나만 어쩌다 대출해서 깨작깨작 낙서해서 다시 꽂아놓는 정도랄까, 즉 지놈 스케일에서 유전자를 마음대로 조작하는 것은 공상과학 소설에서나 나오는 이야기처럼 취급되었다. 그 이유는 앞에서 설명한 것처럼 수억 bp 에 달하는 염색체에서 원하는 부분만을 슥 잘라서 갈아끼는 것이 힘들었기 때문. 기존에 사용되던 제한효소는 대개 6-8bp 정도의 서열을 특이적으로 인식한다. (퀴즈. 그러면 2억 bp에 달하는 염색체를 6bp를 특이적으로 인식하는 제한효소는 몇 조각을 낼 수 있을까?) 한마디로 말해서 이런 무딘 칼을 가지고 정밀하게 지놈을 깨작거리는 것은 그닥 쉬운 일이 아니었다고나 할까.

그러나 약 10년전부터 이런 한계를 극복하고 10 bp 이상을 인식하여 임의의 지놈 영역을 잘라서 붙일 수 있는 방법들을 개발하고자 여러가지 시도가 진행되었다. 첫번째 시도는 Zinc-Finger Nuclease.

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즉 DNA 결합영역으로 유명한 Zinc Finger 모티프에 Nuclease를 달아서 1, 임의의 DNA를 인식시키고, 2. 이를 잘라보려고 하던 시도였다. 그러나 1. 인식가능한 염기가 약 10bp 정도밖에 되지 않아아서 Off-site effect (원하지 않던 부분도 슥슥 잘라버리는) 가 심했고, 2. 특정한 염기를 인식하려면 이를 인식할 수 있도록 복잡한 유전자를 만들어야 하는데, 이 과정이 극히 번거로웠고 3. 결정적으로 효율이 그닥 높지 않았다라는 문제가 있었다.

두번째 시도는 TALEN (Transcription activator-like effector nuclease)

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이것은 식물 병원균 유래의 DNA 결합부위에 Nuclease를 달아서 역시 선택적으로 DNA를 인식하여 잘라보려고 하던 시도였다. (이 블로그에서도 작년에 다룬 적이 있는 이야기. 안됐어 TALEN 너의 전성기는 고작 1년뿐 ㅋ ) 1. ZFN에 비해서 약 15bp 정도를 인식할 수 있게 되었으므로 좀 더 특이성이 강화되었다는 장점이 있었으나 2. 역시 특정한 염기를 인식하려면 아래와 같은 복잡한 유전자를 합성해야 한다는 단점이 있었으므로 3. 역시 효율은 생각만큼 높지 않았다라는 단점이 있었다. (DNA 결합부위는 다르지만 자르는 것은 결국 ZFN과 마찬가지로 FokI Cleavage Domain을 사용)

그런데 이제 나온 CRISPR/Cas의 경우에는 ZFN/TALEN과는 다르다, ZFN/TALEN과는!

1. ZFN이나 TALEN의 경우 특정 염기서열을 인지하려면 수백 아미노산이 되는 (DNA 로는 수천 bp가 되는) 합성 유전자가 필요. 그러나 CRISPR는 고작 100bp 이내의 RNA 서열만 있으면 그만. 그정도는 합성으로 한번에 해결 가능. sgRNA 만 갈아끼우면 얼마든지 새로운 서열을 인지하는 제한효소가 탄생.

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TALEN으로 시퀀스 하나 뜯어고치려면 이정도 길이의 유전자를 새로 만들어야 하는데

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CRISPR/Cas로는 요거면 됩니다. 뭘 선택할래 물어보는게 뻘쭘할 지경.

2. 효율이 더 높다.

한마디로 말해서 ‘더 잘 자른다’ 인데, 어쩌면 당연한 일일지도 모르는게, DNA binding domain에 어거지로 DNA 를 자르는 도메인을 달아놓은 인공효소보다 원래 RNA template를 가지고 DNA를 자를 수 있게 ‘진화’ 된 cas9 쪽이 더 효율적으로 DNA를 자른다는 게 서로 비교를 통해서 판명되었다.

CRISPR/Cas 시스템이 ZFN이나 TALEN에 비해서 강점을 가지고 있다는 것을 눈치깐 기존의 지놈엔지니어링 하던 랩들은 우루루 CRISPR/cas 시스템으로 몰려가기 시작했다. 그래서 2013년 초에 3개의 논문이 동시에 튀어나와 이 시스템으로 실제로 고등동물 유전체를 변형시킬 수 있다는 것을 확인했다.

이들 중 MIT 의 Feng Zhang. 이 친구는 원래 Optogenetics 하던 친구다.

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Cas9과 sgRNA를 셀라인에서 발현해서 특정 위치를 ‘일단 잘랐다’ 가 세포내의 blunt end repair 기작으로 복구된 곳에서는 제대로 복구가 되지 않아서 잘못된 베이스가 튀어나온다는 것을 발견

그리고 이런 데 안낄리가 없는 하버드의 George Church (일명 교회아저씨..돈냄사를 잘 맡으시는 것과 성과의 관계는?) 아저씨 역시 거의 비슷한 내용으로 백투백으로 싸이언스에 논문 투척.

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거의 비슷한 구성. cas9 단백질 + 원하는 시퀀스에 Cas9에 붙는 Guide RNA만 있으면 지놈자르기 가능. 여기서 중요한 것은 약 23bp 정도의 서열 뒤의 제일 끝에는 NCC로 끝나는 서열이 있어야 함 (

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DNA 잘라서 복구하는 활성을 TALEN과 비교..빠이빠이 TALEN,

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잘라붙이기 활성으로 GFP를 지놈안에~

7. 2013. 원스텝에 낙아웃 쥐를 만들어보셈

여기서까지는 체외에서 배양한 셀라인에 대한 이야기다. 그렇지만 과연 살아있는 생물에서도 이렇게 유전체를 변형시킬 수 있는가? 사실 극히 한정된 모델생물 (쥐, 초파리, 제브라피시) 에 국한된 이야기지만, 기존에도 유전체를 변형하는 것은 가능하였다. (GMO 동물 무시하나염?) 그리고 원하는 유전자를 지놈 내에서 지워버리는 (Knockout) 혹은 변형하는 (KnockIn) 기술도 마우스와 같은 것에서는 가능했다.

그러나 기존의 기술은 비록 광범위하게 사용되고는 있었지만 몇 가지 문제가 있었는데

1. 복잡. 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell)에서 유전자 조작을 한 후, 이것을 배반포 상태의 마우스 수정란에 주입하여 키메라 마우스를 만들고, 키메라 마우스에서 생식세포로 전이되는 돌연변이를 가진 새끼를 찾아서 이것을 교배시키고…어쨌든 몇 번의 교배와 스크리닝을 거쳐서 얻을 수 있는 일이라고 생각하면 된다.

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출처 1줄 요약:복잡해.

2. 마우스만 돼. 심지어 ‘래트’ 도 쉽게 되지 않았다. 개,소,말, 돼지..쏘리. 일단 배아줄기세포를 비교적 쉽게 확립할 수 있는 동물이 아니라면 낙아웃/낙인은 쉽지 않은 상태.

3. 여러개의 유전자를 동시에 건드리려면? 각각을 따로따로 뮤테이션한 낙아웃 쥐를 만들고 쥐 1와 쥐 2를 교배해서…여기서 유전자가 3개 이상이 되면 그 시간과 노력은 기하급수적으로 늘어난다.

그러나 2013년에 MIT/화이트헤드의 루돌브 야니쉬와  앞서말한 Feng Zhang은 (알만한 사람이라면 다 아는 사람) 는 CRISPR/Cas 를 이용하여 간단하게 낙아웃/낙인 쥐를 만들 수 있다는 것을 보여주었다.

첫번째

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1. 기존에 knockout mouse 만들던 방법대로 ES Cell에서 Cas9과 sgRNA를 이용하여 4개 유전자를 동시에 낙아웃하여 ES Cell을 배반포에 이식하거나

2. 아니면 마우스의 수정란 (1 Cell Embryo – Zygote) Cas9 과 sgRNA RNA를 Cytoplasm (이전에  형질전환 쥐를 만들때처럼 Pronuclues에 injection을 하는 것이 아님. Cas9 와 sgRNA RNA를 injection하면 Translation 된 Cas9에 sgRNA가 붙어서 핵 안으로 들어감) 에 주입하면 핵 안으로 들어가 DNA을 쓱삭쓱삭~ 그 다음에 배아이식을 통해서 원스텝으로 쥐를 짜잔!

두번째

이번에는 Knock-In이다! 기존에 tissue-specific 한 deletion을 만들려면 특정한 locus에 loxP 사이트를 넣는 작업을 했어야 하는데 이 역시 ES Cell을 거치는 노가다 작업. 그러나 이것도 Cas9과 sgRNA를 zygote에만 주입하면 원스탭으로 끝나염

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게다가 원하는 locus에 정확하게 GFP fusion을 이제 만들어 놓을 수 있다! (Santa Cruz Biotech가 이 뉴스를 싫어합니다)

8. 초파리, 제브라피시, 쌀, 애기장대…

셀라인과 쥐라면 다음은 뭐냐?

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“이런 연구를 하면 밥이 나오냐 쌀이 나오냐” 하셨던 고갱님. ‘낙아웃 쌀’ 이 요기잉네요.

모델생물의 대표라고 할 수 있는 초파리가 빠질 수 없죠. 

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Zebrafish

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누에. 

이게 일년도 안되서 모두 이루어진 일이다. 분명한 것은 ‘쌀이 나오냐 밥이 나오냐’ 식으로 시작된 연구를 해서 결국 ‘쌀’ 이 나왔다는 것이다. 

9. DNA 자르는 것으로 그칠 줄 알았지?

CRISPR/Cas9이 특이적으로 DNA를 자를 수 있다는 특성을 이용해서 ‘DNA는 자르지 않고 지놈 펑션을 연구하는’ 여러가지 트릭들도 나오기 시작하였다.

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DNA를 자르지 못하게 뮤테이션이 들어간 Cas9을 이용하여 Translation을 블락

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이번에는 유전자에 변형을 하지 않은 상태에서 단지 발현이 잘 안되던 유전자를 Activation

일년 새에 하도 많은 어플리케이션이 나와서 쫒아가기가 힘들 지경이다. ;;;

10. Editas Medicine : 지놈 수술?

이렇게 불과 일년만에 폭풍이 몰아치듯 온갖 생물에 걸쳐서 지놈에디팅이 기존에 없었던 높은 효율로 가능하다는 것이 보고되고 여러가지 다른 어플리케이션이 나온 이상 이러한 것이 상업적인 이용이 되지 않을 수가 없었다. 지난 11월말, George Church, Feng Zhang 등 CRISPR/Cas 로 지놈에디팅을 주도한 사람들에 의해서 Startup이 설립되었다. 이름은 Editas Medicine. 초기 자본 4300만불.

사실 차세대시퀀싱 (Next Generation Sequencing) 기술이 보편화되고, 이제 몇천 불이면 개인의 지놈시퀀스를 ‘거의’ 알게 된 시점에 있어서 이 정보를 궁극적으로 활용하는 것은 무엇인가에 대한 회의가 많이 있었다. 가령 이런 기술이 보편화되어 개인당 천불, 아니 백불에 시퀀싱을 할 수 있게 된다고 하자. 그래서 시퀀싱을 했더니

“고갱님 시퀀싱 결과를 보니 BRCA1/BRCA2 등등에 아~주 위험한 뮤테이션이 디글거립니다. 님 암 걸리는 거 기정사실임. 마음의 준비를 단단히 하삼”

….음 그리고 땡?

물론 안젤리카 졸리 눈화처럼 이런 검사결과만을 보고 과감하게 예방적 유방절제술를 받을 쿨하면서도 용감한 여성분들도 어딘가는 있겠지만 대개의 경우는 ‘어쩌라구염?’ 밖에 할 수 없는 게 사실. 그런데 지금은 아니더라도 이제 지놈을 어떻게든 슥삭슥삭할 수 있다면?

사실 이미 수천억개의 다세포 생물로 성장해 버린 성인이야 어쩔 수 없다고손 치더라도, 가령 치명적인 유전자를 물려받을 수도 있는 자식이 ‘세포 하나’ (수정란) 일때 이러한 ‘유전자 수술’ 을 한다면? 분명한 것은 쥐 레벨에서는 지금 이미 이런것들이 가능해졌다라는 것이고, 쥐 수정란에서 되는 것이라면 사람 수정란에서도 기술적으로 크게 어렵지 않게 가능할 수 있다는 것이다. 문제는 ‘성공률’ 의 문제겠지만. 

여기서 조금 더 나아가면 강남 성형외과의 성형수슬을 아예 수정란 단계에서 지놈 레벨에서 해버린다면?

상업적인 것을 떠나서 앞으로 사회적, 윤리적으로 폭발적인 문제가 될 수 있는 판도라의 상자가 열려버린 것은 아닐까?

11. 그러나 시작은 잉여 DNA로부터..

CRISPR/Cas가 불러일으킨 것은 가히 ‘광풍’ 이라고 표현될 만할 일이었다. 즉, 제한효소/PCR 이래에 생물학의 기본적인 연구방식을 또 다시 바꾸어버리는 혁신적인 기술이 나왔다는 것은 그렇다치고, 이 기술이 앞으로 불러올 경제/사회적 파급효과는 지금으로는 상상하기 힘들 것이라고 생각한다.

그러나 여기에 대해서 상상을 펼치는 것은 조금 나중으로 미루어두고, 여기서 이 글을 쓰게 된 동기를 생각하보자. 이게 다 처음의 “junk DNA인지 뭔지 알수없는” 그런 묘한 DNA의 발견으로부터 촉발된 일이라는 것. 중요한 과학적인 발견, 그리고 사회적/경제적 효과를 만드는 발견들 중 상당수는 이렇게 의도치 않은 우연찮은 발견, 누가 보아도 ‘밥이 나올지 쌀이 나올지 모를’ 그런 연구로부터 시작되었다. 이런 것은 비단 CRISPR/Cas 의 예가 최초가 아니다. 사실은 1차 ‘유전공학 광풍’ 을 몰고왔던 1970년대의 제한효소의 발견 역시 그 원류는 하찮은 박테리아와 여기에 기생하는 플라스미드라는 DNA 쪼가리에서 나왔다는 것. 이런 것은 진정으로 경제사회적으로 대박이 터지는 연구의 근간은 처음에는 누가 봐도 절대 돈 될 성 싶지 않은 연구에서 나온다는 예를 다시한번 확인시켜 준다.

그러나 사실 기초과학은 이런 ‘잿밥’ 을 얻기 위해 하는 것일까? 기초과학은 그냥 그저 개인의 호기심을 충족시키기 위해 하는 거다. 그러다가 어쩌다 원치 않은 부수입(?)이 생기면 그걸로 좋은 거고. 파인만 아저씨가 했다고 주장되는 유명한  이야기로 글을 마치고자 한다. 

‘Physics is like sex: sure, it may give some practical results, but that’s not why we do it’. 내일 클마스 이브인 연인 중에서도 실용적인(?) 결과를 내실 분들이 있겠지만 그걸 바라신 건 아니시겠죠

“이런 걸 연구해봐야 밥이 나오냐 쌀이 나오냐” 하던 어떤 연구의 말로 (전편)

0. 잡설

주변에 과학자가 있는 사람이라면 그 사람이 무슨 연구를 하고 있는지 자세히 물어본 적이 있는가? 전문용어 쓰려고 하면 “전문용어 말고, 좀 쉽게 설명해봐” 해 가면서. 그렇게 해서 설명을 들어 봤더니  “저런 거 연구해서 도데체 뭐에 써먹음? 난 또 과학자고 박사래니까 무슨 대단한거 하는 줄 알았구만 ㅋㅋㅋㅋ” 이라고 생각해 본 적은 없는가?

….뭐 솔까말 본 블로그 주인이라도 학회라도 가보면 아무리 동업자 쉴드가 쳐진다고 하더라도 솔직히 저런 거 왜 하는지, 저런 것을 알면 왜 중요한 것인지 잘 이해가 안될 경우가 많은데 일반인이라면 오죽하겠느냐고.

그렇다면 이런 것은 왜 하는가? 솔직히 지금 해봐야 돈이 나오는 것도 아니고 쌀이 나오는 것도 아닌 그런 자기만의 세계에 빠져서 우리의 혈세를 낭비하는 과학자넘들~ 참 나빠요 그쵸?

근데 원래 과학자라는 게 다 그런거다. ㅋ 

과학자는 자기 궁금한 것을 알아보기 위해서 너님들의 혈세를 낭비해 가면서 연구를 하는 게 직업이니까..꼬우세염? 님도 과학자 하셈..

이런 이야기를 듣고 어처구니가 없어서 하실 분들은 이렇게들 이야기하실 것이다. “그래도 뭔가 좀 인류의 미래를 위해서 연구한다고 하면 안돼니? 기상이변, 에너지고갈, 암퇴치, 불로장생, 우주정복, 주색잡기‘ 물론 많은 분들은 이런 명분으로 조금 더 많은 혈세를 타가시긴 하지만 사실 이런 명분에 대한 뾰족한 답은 크게 못 내놓으시는 경우가 많다. 결국 이런 명분은 자기가 궁금한 것을 알아보기 위해서 여러 호갱님들의 주머니를 좀 더 효율적으로 털기 위한 명분이라니까.. 업계의 공공연한 비밀을 대중에게 폭로하는 MadScientist는 자폭하라 

그럼에도 불구하고 과학자가 아닌 너님들은 나님의 궁금증을 해소하기 위해서 세금을 내실 신성한 의무가 있는 거다. 왜? 그게 인류가 진보해 온 방식이다. 원시인 시절 하라는 곰새끼와의 현피는 안뜨고 어디 짱박혀서 돌멩이나 가지고 놀던 잉여 원시인 1인에 의해서 인간은 도구를 발견하게 되어서 곰새끼의 브런치가 될 위기를 면했고, 나뭇조가리나 깨작거리던 또 다른 1인에 의해서 불을 발견하게 되었고 그리고 곰탕을 먹게 되는데..

“그건 그때, 지금 너님들이 하는 것은 밥도 안나오고 쌀도 안나오는 혈세낭비” 라고 하실 분들을 위해서 요즘의 전형적인 “아무리해도 돈나오는 것과는 관계없을 연구들” 몇가지를 소개해보도록 하자.

1. 1987. 어떤 잉여 DNA

1987년.  일본 오사카대학. 새로운 유전자 클로닝하면 좋은 박사학위 논문이 되던 시절에 어떤 연구자 한명이 어떤 유전자를 클로닝하여 논문을 발표했다. 여기서 발견하고자 한 유전자가 뭔지는 그닥 중요하지 않다.

어쨌든 시퀀싱을 해서 원하는 단백질을 코딩하는 ORF를 찾고 나니 음? 뒤에 요상한 시퀀스가 있네~ 라는 사실을 인지하게 되었다.

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stem-loop 같은 구조같기도 하고? 근데 뭐하는 넘인지는 모르겠다 ㅋ 그냥 날로먹는 Fig 하나 벌었다 ㅋㅋㅋㅋ

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그리고 논문에는 뭐 요상한게 있는데 뭔진 모르겠다능~ 뭐 걍 정크 DNA가 요기잉네~ 이라고 쓰고 넘어갔다. 사실 과학자가 잉여스러운 관심을 보이는 게 직업이라고 해도 이런 것은 요상하긴 하지만 뭔지 알도리가 있으니 아무리 잉여스러운 과학자라도 이런게 왜 있냐, 뭔 기능을 하냐를 차마 뒤벼볼 용기는 없었다.

그리고 어느정도 세월이 흘렀다.

2. 2002. 정크 디엔에이가 요기죠기 잉네?

2002년. 1987년에는 유전자 하나 클로닝하여 시퀀싱하면 박사 논문이 될 시절이었지만 이제 2002년 정도가 되면 휴먼 지놈 프로젝트에 의한 기술의 발전으로 박테리아 하나 따위는 몇년 정도 시간이 걸리면 전체 지놈서열이 나오던 시절이 되었다. 수백개의 박테리아 지놈 시퀀스가 쏟아나왔다.

이런 지놈 시퀀스를 여러가지 훑어보던 네덜란드의 한 연구자가 이전에 1987년에 발견된 시퀀스가 사실은 여러가지 세균과 고세균에 존재한다는 사실을 알아냈다. 그래서 이런 논문을 냈다.

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각종의 박테리아에 비슷한 반복서열이 모여서 존재하는 경우가 많드라. 그래서 이런 서열을 “일정간격으로 규칙적으로 모여있는 작은 문회(palindormic repeat) 서열” clustered regularly interspaced short palindromic repeats  라는 진짜 멋대가리없는 이름으로 규정했다.

그런데 이런 잡스러운 시퀀스 근처에 보면 단백질들이 있는데, 각 종의 세균에 보니 비슷한 아미노산 서열을 가지는 비슷한 계열의 단백질들이네?

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근데 뭐하는 단백질인지는 모르겠다. 그렇지만 아까 그 잉여스러운 시퀀스에 관련되어 있는건가부지? 그래서 clustered regularly interspaced short palindromic repeats  에서 cas 라는 이름을 붙였다.

그리고 나서 논문 하나 내고 잊어버렸다. ㅋ 아직도 이게 뭐하는 시퀀스인지는 알지 못하는 상태였다.

3. 2007. 감기에 걸리는 유산균

이제 좀 더 시간이 지나서 이제는 2000년대 중반. 덴마크의 요구르트 회사 DANISCO

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요구르트이든 MSG이든 대량의 미생물을 배양하여 발효를 하는 공정에서 가장 큰 문제는 오염. 오염에는 곰팡이 (fungi), 다른 박테리아 등등 여러종류가 있겠지만 가장 심각한 오염이라고 한다면 박테리오파지 (bacteriophage) 에 의한 오염이다. 본 블로그 주인과 동종 업자라면 박테리오파지가 뭔지 정도는 알겠지만 모르는 분이라면 간단하게 말해서 박테리아에 감염되는 바이러스. 뭐 그런거 있다.

“풋~ 박테리오파지는 1950-60년대에 다 연구된거잖아염 저런 시덥잖은 거 가지고 고민하는 님들 좀 한심”이라고 생각하는 양반들도 있겠지만 뭐 그때 연구된 것은 주로 E.coli에 감염되는 coliphage. 그것도 막스 델뷰릭이라는 전직물리학자출신 아저씨가 ‘뭐 우리 여러가지 각자가지고 싸우는데, 그러지 말고 한 서너가지만 가지고 드립다 팝시다‘ 하고 선정된 몇 가지의 박테리오파지. 즉 유산균 등의 산업미생물에 기상하는 파지에 대해서는 아직도 잘 모른다.

여튼 여기는 요구르트 회사이고, 요구르트 발효 도중에 한번 감염되면 컬춰를 완전히 망치는 유산균 박테리오파지에 대한 연구를 조금 진행하고 있었고, 이러한 박테리오파지에 내성이 있는 유산균을 개발할 수 없을까 하고 연구를 하고 있었다. 그런데 재미있는 현상이 발견되었다. 

a 산업적으로 표준처럼 사용되는 유산균이 하나 있었다.

b 여기에 분리한 박테리오파지를 감염하니 당연히 대부분의 균이 싸그리~ 죽었는데, 이 와중에 살아서 콜로니를 형성하는 넘들이 있어!

c 뭐 대개의 사람이라면 여기서 ‘훗 컨탐된겨?’ 하고 버렸겠지. 근데 이 연구자는 이걸 그냥 컬춰해 봤음. 음 컨탐 아니고 유산균 맞음.

f. 근데 여기에 다시 박테리오파지를 감염시켜 봤음. 이젠 안죽어!

오오 이제 박테리오파지에 내성이 있는 유산균 만든 것임? 근데 유산균에 감염되는 파지는 여러가지가 있었음. 그래서 다른 종류의 파지를 감염시켜보니까 캑~ 뭐야. 이러면 쓸모가 없잖아…

뭐 웬만한 산업계의 R&D라면 여기서 그만두었겠지만, 그 연구자가 좀 잉여기질이 있었는지 아니면 회사가 좀 널럴했는지 왜 이런 현상 (사람이 수두바이러스에 한번 감염되면 내성이 생기는 것처럼 유산균도 파지에 한번 걸렸다가 살아남으면 내성이 생기는) 이 일어나는지를 좀 뒤벼보기로 했다. 그래서 논문서치신공.

그런데 찾아보니 대충 이런 논문들이 나왔다. 

CRISPR라는 이름의 세균에 많이 있는 요상한 반복서열이 있는데 이런 것은 파지나 플라스미드의 서열과 비슷하다

그래서 혹시 이런게 파지에 대한 면역현상과 관련있는지 실험을 시작했다.

1. 우리 유산균에도 비슷한 CRISPR 시퀀스가 있어!

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2. CRISPR의 repeat 사이에 있는 시퀀스가 파지의 시퀀스와 비슷해!

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3. 특정 파지에 저항성이 있는 유산균에는 해당 파지의 시퀀스가 CRISPR 안에 존재해!

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4. CRISPR 옆에 있는 cas 유전자를 deletion 하니 면역이 사라져! 즉 이 유전자들은 파지에 대한 면역에 관여하는 것일꺼야..

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즉 결론적으로,

1. 유산균에 박테리오파지를 감염시키면 해당 파지에 대한 면역성이 생길수가 있는데

2. CRISPR라는 정체불명의 유전자 쪼가리들은 특정한 파지에 대한 면역성을 주기 위해서 파지의 DNA 쪼가리를 잘라서 자기 지놈상에 기억해 놓은 흔적이며,

3. 이렇게 지놈내에 ‘기억’ 된  파지에 대한 내성은 cas 유전자들이 부여한다.  

물론 이 시점까지는 어떻게 내성이 부여되는지에 대한 것은 연구가 안된 상태.

물론 아직도 “이걸 하면 돈이 나와 밥이 나와” 의 연구지만 과학적으로는 큰 의미가 있는 연구가 되었다. 즉 기존에 고등동물에만 존재한다고 생각되는 적응성 면역 (Adaptive Immunity – 뭐 쉽게 말해서 항원항체반응) 이 박테리아와 박테리오파지에서도 성립한다는 것은 나름 획기적인 결과. 그래서 논문이 ‘과학’ 이라는 주간지에 실리게 되었다. 

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싸이언스를 정ㅋ벅ㅋ 한 요구르트 회사의 연구진

이제 이십년 전에 박테리아 유전자 근처에서 발견되었던 희한한 시퀀스 하나는 많은 과학자들의 관심을 끌게 되는 유전자가 되었다. 물론 여전히 ‘박테리아도 면역이 있네~ 세상에 희한한 일도’ 수준의 관심이랄까. 관련분야 덕후 학자들의 입장으로는 매우 흥분되는 일이었지만 일반인이나 (요구르트 업계를 제외한) 산업계, 매스미디어가 크게 관심을 끌 일은 아니었다. 

그러나 이들 대다수, 심지어 해당 연구를 수행한 연구자들도 앞으로 몇년 후에 벌어질 일에 대해서는 예상하지 못한 상태였다.

To be continued…