로절린드 프랭클린 (Rosalind Franklin, 1920-1958) 이라고 들어보셨음?
물론 모르는 분은 모르시겠지만, 이 블로그에 들락거릴 분이라면 어디선가 이름을 들어봤을 것이다. DNA 발견 히스토리에 대해서 좀 알고 계신 분이라면 “아~ DNA 구조사진 찍었는데 왓슨이 훔쳐가서 노벨상 못타고 몇년후에 요절한 눈화?” 정도로 기억할수도 있다.
이런 사진을 이 눈화가 찍었는데
얘내들이 훔쳐가서 이 누나는 분노속에 화병도져 요절했다?
글쎄, 로절린드 프랭클린은 그정도로 기억되어야 하는 인물일까? 이러한 대중 속의 이미지와 실제 로절린드 프랭클린이 그닥 길지 않은 인생동안 남긴 족적과는 큰 차이가 있다. 여기에 대해서 조금 글을 쓰도록 하자.
1. 로절린드 프랭클린이 살아있었으면 노벨상을 받았을까?
나의 대답은 “예” 이다. 그러나 한가지 의외로 느낄지도 모르겠지만, 나는 이 사람은 왓슨과 크릭 (그리고 모리스 윌킨스) 이 노벨상을 받을때 같이 노벨상을 받았으리라고 생각하지는 않는다. 그렇다면? 이 사람은 그 이후에 별도의 업적으로 노벨상을 받았을 것이라고 생각한다.
Prize motivation: “for his development of crystallographic electron microscopy and his structural elucidation of biologically important nucleic acid-protein complexes” 결정학적 전자현미경과 생물학적으로 중요한 핵산 – 단백질 복합체의 구조결정
음 이게 뭔데? 그런데 이 사람은 1953년 영국의 Birbeck College라는 곳에서 처음 연구를 시작하였는데, 이때 이 사람은 바로 다름아닌 로절린드 프랭클린과 함께 연구를 한 사람이다. 이 사람과 로절린드 프랭클린의 연구주제는 담배모자익 바이러스 (Tobacco Mosaic Virus) 의 구조결정. 로절린드 프랭클린은 킹스칼리지에서 DNA 연구를 마치고 Birbeck College 로 옮겨서 담배모자익 바이러스의 구조가 어떻게 생겼는지에 대해서 X선 회절에 의해서 연구를 시작했다. 이때 같이 참여한 사람이 Aaron Klug 즉 이 아저씨는 로절린드의 부사수였는데 나중에 N모상 득템.
로절린드 프랭클린이 DNA 연구 이후에 1958년 요절하기 이전까지 어떤 업적을 이루었는지는 요기 혹은 죠기 를 뒤벼보면 잘 나온다. 그러나 간단히 요약해보자.
1. 기존에도 JD Bernal 과 같은 사람들에 의해서 TMV 바이러스에 대한 X선 회절실험이 이루어진적이 있었다. 그러나 X-ray 덕후녀였던 프랭클린 눈화는 기존보다 더 나은 아래와 같은 회절사진을 찍었으며
이전의 DNA 사진과는 비교가 안되는 알흠다운 사진
2. 이러한 데이터를 해석하여, 1955년, 최초로 TMV의 구조 – 이자 최초의 바이러스 구조 – 를 제시하게 되었다. 그리고 자연에 논문을 꽝 이 누님은 자연쯤에는 내고 싶을 때 논문을 내는 여자라고!
즉 이런식으로 단일가닥의 RNA가 나선형으로 말려있고 캡시드 단백질이 차곡차곡 쌓여있는 모델을 제시하였다. 결국 이 모델은 후학들에 의해서 좀 더 자세하게 만들어졌으며 근본적으로 프랭클린이 1955년에 제시하였던 모델이 맞다는 것이 증명되었다. 이것은 인류 최초의 바이러스 구조 규명인 셈이다.
3. 이후에 이 눈화는 다른 바이러스 구조, 즉 TMV와는 다른 모양인 폴리오 바이러스 (Polio Virus), 튤립 옐로우 모자익 바이러스 (TYMV) 등의 구조규명에 노력을 다했다. 그러나 안타깝게도 1958년 4월에 난소암으로 37세의 젊은 나이로 세상을 떴다 ㅠ.ㅠ
이 눈화는 죽기 한달전까지도 새로운 프로젝트를 구상하고 있었다. 바이러스 (Potato virus X) 라는 바이러스의 구조를 알아보기 위하여 협력연구자에게 샘플을 요청할 정도로..
어쨌든 요점은 이 눈화는 굳이 DNA 가지고 스웨덴에 가지 않더라도 충분히 그정도의 업적은 쌓았고, 요절하지 않았더라면 훨씬 더 대단한 발견을 했을 것이다. 부사수가 같은 토픽 가지고 계속 연구해서 노벨상 탔대니깐 뭔 말이 필요하냐. 글니까 연구자 여러분들은 건강 잘 챙기삼. 아무리 대단한 발견을 해도 죽으면 노벨상이건 뭐건 국물도 없음.
2. DNA 이중나선 모델은 로절린드 프랭클린의 것인데 왓슨 크릭이 훔쳐갔다?
아뇨.
많은 사람들이 로절린드 프랭클린을 “왓슨크릭에게 데이터 뺏기고 요절한 불운의 과학자” 정도로 생각한다. 그러나 요절했으니까 불운한 과학자일수는 있고, 왓슨-크릭이 그 구조모델을 만드는데 프랭클린의 데이터를 훔쳐본 것에 기여하긴 했지만 사실 프랭클린의 관점에서 그 데이터는 사실 너무 꾸려서 모델을 만들 시도도 안했을 뿐이다가 좀 더 정확한 이야기이다.
“우리는 요 사진에 대해서 너무 과대해석을 하지는 않겠지만 다음과 같은 결론을 내릴 수 있음.
– 구조는 아마 나선형일 것이고,
– 인산그룹은 구조의 밖으로 위치해서 나선에서 20A 의 직경으로 존재할 것이다.
– 아마 나선은 두개의 수직으로 대칭된 분자로 구성될 것임
…
즉 우리생각은 이전에 왓슨 & 크릭 이친구들이 제시한 모델과 불일치하지는 않음.”
Thus our general ideas are not inconsistent with the model proposed by Watson and Crick in the preceding communication
즉 걔내들이 말하는게 우리 아이디어와 일치하지 않는건 아냐. 글타고 걔내들이 말하는게 다 맞는지 아닌지는 내가 알바가 아니고ㅋ 정도의 이야기. 사실 위 논문의 모든 내용은 프랭클린이 왓슨 크릭이 모델을 구축한 것을 보기 전에 쓴 이야기이고, 단지 왓슨 크릭의 모델을 본 다음에 “흥 뭐 걔내가 뭐라고 하는 모델과 내생각이 딱히 불일치한것은 아냐 흥” 하고 한마디 덧붙였다고 한다 츤데레가 요기잉네?
사실 왓슨 크릭 모델의 가장 핵심이라고 할 수 있는 염기간 베이스 페어링 (A-T, G-C) 에서는 당연히 아무런 말이 없는데, 그 당시 프랭클린이 뽑은 데이터만으로는 절대 베이스 페어링에 대한 이야기를 할수 없으므로, 프랭클린은 아마도 이 데이터 가지고 이런 구체적인 모델을 만드는 것이 너무 오버라고 생각했을지도 모른다.
실제로 구조생물학적으로 왓슨 & 크릭의 DNA 이중나선, 염기쌍 구조가 원자수준에서 규명된 것은 이보다 훨씬 이후인 1981년의 일이다.
3. 왓슨 & 크릭과 프랭클린은 사이가 나빴다?
그닥 나쁘지는 않았는데염?
왓슨 & 크릭이 모델을 구축할때 프랭클린의 사진에서 결정적인 힌트를 얻은 것처럼, 프랭클린 역시 DNA 구조를 해석할 때 크릭이 제시한 이론에 의해 큰 영향을 받았다. 이것은 프랭클린 버전의 구조해석 논문에도 잘 나와있음.
사실 왓슨과 크릭과 이사람과의 사이도 나쁘지 않았음. 왓슨은 프랭클린이 TMV 구조푸니까 “오오 눈화 미쿡와서 제발 톡해주세염~구조좀 보여주세염~ 현기증난단 말이예여” 하고 편지를 몇번 썼고 프랭클린이 미쿡에 오니까 직접 운전기사해서 동부에서 서부까지 모셨다는..(근데 프랭클린 눈화가 돌아가시니 뒷담화하는 책을 써…)
사실 프랭클린이 TMV연구를 하기 전에 왓슨은 TMV에 대해서도 좀 발을 담근 적이 있는데 사실 TMV의 capsid 단백질이 helical 한 구조를 하고 있다는 것을 처음 실험적, 이론적으로 규명한 것은 왓슨이었다. 논문 재미있게도 왓슨은 DNA 이중나선 구조에 대해서는 전혀 실험을 한 적이 없는데, TMV에 대해서는 직접 실험을 했다는..사실 왓슨이 프랭클린의 사진을 한번 보고서 ‘오오 이것은!’ 하고 힌트를 얻게 된 결정적인 이유라면 같이 나선구조를 가진 TMV에 대해서는 자기가 실험을 해 본 이유일수도 있다. 어쨌든 프랭클린의 연구 자체는왓슨의 선행연구에 영향을 받았고, 이 둘은 서로 연구결과를 토의하는 사이었지 세간에 알려진 것처럼 그리 사이가 나쁜 상황이 아니었다.
사실 이러한 오해가 나오게 된 것은 어떻게 보면 왓슨의 책임이 큰데, 그는 1968년에 출판된 자신의 저서 (라고 쓰고 디스모음집이라고 읽는다) 인 ‘이중나선’ (Double Helix)에서 프랭클린을 좀 괴팍한 여자 정도로 묘사했다. 그런데 이 책이 베스트셀러가 되어 버렸어! 그러다 보니 이 사람의 이미지가 그런 식으로 고착된 점이 크다.
4. 프랭클린의 유산
프랭클린이 죽고 나서 프랭클린과 같이 연구를 하던 동료들은 캠브리지의 MRC 로 옮겨가서 그녀가 수행하던 바이러스 구조연구들을 계속 수행하였다. Aron Klug 은 이 연구를 계속해서 스웨덴에 갔다는 것은 이야기했고..
그녀의 대학원생으로 Kenneth Holmes라는 사람이 있었다. 이 사람은 Aron Klug 과 함께 바이러스 연구를 같이했고, 이 연구가 어느정도 마무리된 다음에는 독일의 막스플랑크 연구소로 옮겨서 다른 생체고분자, 그리고 역시 나선의 성질을 가진 구조를 연구했는데, 이게 바로…
액틴 필라멘트 모델이다. 참고로 이 모델은 DNA 구조와 TMV 에 사용된 방법인 Fiber diffraction 을 이용하여 결정되었다. 즉 고해상도의 구조를 결정할때 사용되는 단일결정에 의한 X-ray Crystal Diffraction 이 아니라는 것이다.
어쨌든 지금 프랭클린 눈화의 박사과정 학생이 푼 구조를 가지고 또 찝적거리는 찌그레기 1인인 본 블로그 주인의 경우에는 결국 구조생물학에서의 족보를 따져보면 로절린드 프랭클린 눈화까지 올라가게 되는 셈이다. 그러니까 우리눈화 가지고 괜히 설레발 떨지말라구..ㅋ
“끝나기 전에는 끝난 것이 아니다” (it’s not over until it’s over)라는 말이 있다. 왕년의 MLB 레전드인 요기 베라라는 사람이 처음 쓴 말이다.
그러나 여기서 야구 이야기를 하자는 게 아니고 이 글에서 “끝나기 전에는 끝난 게 아니다” 라는 것은 지놈시퀀싱 이야기이다.
요즘은 워낙 시퀀싱 기술이 발달되어 있고, 개인의 지놈시퀀스도 며칠만에 시퀀싱을 할 수 있네 하는 퍼스널 지놈 이야기, 그리고 수십, 수백만명의 사람의 지놈을 시퀀싱한다는 이야기 등등이 나오기 때문에 특정한 종에 대한 시퀀스 쯤은 마음만 먹으면 얼마든지 간단히 뽑을 수 있는 것처럼 생각되곤 한다. 그러나 과연 그럴까?
약 십몇년 전에 클린턴 아저씨가 하얀집에 사실때 이 아저씨는 옆에 두 사람 (Francis Collins, Craig Ventor)를 세워놓고 휴먼 지놈 시퀀싱을 완료하였다는 발표를 하였다.
도원결의 아니면 삼당합당
이게 2000년도의 이야기이다. 그러나 문제는 이때 완성된 것은 “휴먼 지놈 시퀀스의 초안” 이 만들어졌다 정도의 이야기이고 초기 분석이 시작되었다는 이야기이다.
그렇다면 ‘초안’ 은 무엇이고 ‘완성본’은 무엇인가? 흔히 우리가 지놈 시퀀스라고 생각한다면 이런 식으로 생각한다. 인간은 23+1개의 염색체를 가지고 있으므로 23+1개의 연속된 시퀀스가 있겠지? 그리고 circular chromosome 으로 되어있는 박테리아의 경우는 하나의 시퀀스가 있겠고. 그러나 2001년에 발표된 ‘Human Draft Genome’ 은 어느정도의 수준이었나? 2001년 발표된 휴먼 지놈 초안 논문의 Table 6을 보면 대략적으로 짐작할 수 있는데,
보통 지놈시퀀싱 하는 사람의 업계용어로 Contig 라고 하면 하나의 연속적인 시퀀스 쪼가리를 의미한다. 가령 위의 논문에서 전체 Contig의 갯수가 4884개가 되어있다는 이야기는 원래 23+1 (남자는 Y Chromosome이 하나 더 있으니 +1 ㅋ ) 쪼가리가 되어야 할 것이 4884조가리가 나있다라는 것이다. 그리고 N50 Contig 사이즈는 제일 긴 Contig부터 짧은 Contig 끼리 죽 줄을 세운다고 할때 전체 지놈 시퀀스의 절반이 포함되는 위치의 Contig Size를 의미한다. 당연히 이 크기가 길수록 지놈의 완성도가 높다고 봐야지? 아무튼 2001년에 공개된 시퀀스는 전체 휴먼지놈 시퀀스를 대충 5000조가리 정도로 내놓은 불완전한 시퀀스였다고 생각하면 된다. 이 정도면 양반이고, 휴먼지놈 시퀀싱 콘소시움과 동시에 휴먼지놈 시퀀스를 ‘완료’ 했다고 대중에게 알려진 Craig Venter 와 그 똘마니들이 내놓은 시퀀스는 이보다 훨씬 못미치는 퀄리티의 저질 지놈이었다. 게다가 몇 년 후에는 휴먼지놈 시퀀싱 콘소시움의 데이터를 몰래 빌려썼다는 의혹컨닝지놈도 받았거니와.
벤터네는 17만개의 쪼가리. 17만개 쪼가리 vs 4884 쪼가리. 둘다 제대로 된게 아니니 오십보 백보일까? ㅋㅋ
어쨌든 휴먼지놈 시퀀스가 최초로 공개된 이후 그동안 2-3년에 한번씩 개정판이 나왔고, 얼마전에는 Version 38 이라고 생각되는 GRCh38 이 나왔다. 이걸 한번 둘러보자.
약 15년간 지놈 시퀀스를 improve 했음에도 불구하고, 아직도 휴먼 지놈은 약 1385 쪼가리가 나 있는 상태이다. 그리고 그 쪼가리 사이에 있는 시퀀스 (우리는 아직 그 시퀀스의 내용을 모르는) 의 길이는 159,970,007 bp가 된다. 그렇게 많은 시간과 노력을 투자했음에도 아직도 휴먼 지놈 시퀀싱은 현재진행형이다. 아직 끝나기 전에는 끝난 게 아니다라는 이야기.
그렇다면 완전히 끝난 지놈 시퀀스, 즉 박테리아라면 하나의 시퀀스, 여러개의 염색체를 가진 생물이라면 그 염색체수만 있는 지놈 시퀀스는 어떤게 있나? 일단 대개의 박테리아의 경우 ‘완전히 끝났다’ 라고 할 수 있다.
이 정도까지다. 이것보다 지놈이 복잡해지는 것들은 사실 아직 다 안 끝났다. 사실 지놈 사이즈가 작아서 모델로 쓰이는 초파리, 애기장대만 보아도 아직까지 Gap 이 남아있을 정도니까.
그나마 주로 많이 연구된 모델 생물, 즉 사람, 쥐, 초파리, 애기장대…등등만 해도 사실 지도에 약간 안보이는 부분이 있다뿐이지 전체적인 지놈에 대한 비교적 완벽한 지도를 가지고 있다고 생각해도 된다. 즉 자신이 연구하고자 하는 유전자가 거의 대개는 지놈상에 어떤 위치에 어떻게 있는지 알고 있으므로..지도로 비유한다면 약간의 음영지역은 있지만 거의 모든 영역이 다 커버된다 정도?
개..까지만 가도 지놈은 2만7천 쪼가리가 나있다. 포유류로 비슷한 지놈사이즈를 가진 사람, 마우스 등의 경우에는 3자리수 Contig를 가진 것에 비하면 참 차별대우가 심하다. (그러니까 십이간지에서 끝발이 높았어야지)
소라면?
개만도 못한 소ㅋㅋㅋ
말이라면? (어째 개나소나말이나 순서로 가는것 같지만 신경쓰면 지는거다)
비슷한 수준.
이 정도라면 지도로 비유한다면 중요한 랜드마크, 큰 건물은 나오는데 골목길에 들어가면 지도에는 아예 공백으로 나와있는데 길이 막혀있거나 그런 경우가 수도없이 나오는 경우다. 그래도 염색체별로 대략적으로 배열되었으므로 좀 누더기같지만 대충 길을 찾아갈 수 있는 수준.
그나마 이정도면 이전 생거시퀀싱 시절에 리드당 800bp정도로 된 시퀀스를 써서 어셈블리되서 퀄리티가 좋은 편이다. 문제는 요즘 나온 NGS 시퀀스 기기로만 수행된 생물 잡생물들의 퀄리티인데, 이들은 기껏해봐야 150-300bp 정도의 숏다리 시퀀스를 써서 어셈블리된 양산형 지놈이기 때문에 극히 퀄리티가 떨어지며, 심지어는 각각의 contig 들이 크로모좀에 맞게 배열되어 있지 않은 경우도 많다.
팬더 “우리는 천민지놈. 천민에게 염색체에 맞게 시퀀스가 배열되어 있기를 기대하는 건 무리 ㅋㅋㅋ”
이정도 되면 자신이 원하는 유전자 중 코딩 리전의 시퀀스가 빠져있다거나 하는 경우도 심심치 않게 발생하는 편. 역시 지도로 비유하면 이 정도는 고속도로 타고가다가 중간에 공사가 안된 부분이 있는데도 그게 표시가 되어 있지 않거나, 지도가 전라도, 경상도, 서울시 등으로 구분되어 있지 않고 동별 축적의 지도가 마구 찢어져서 쪼가리로 널려있는 수준. 없는 것보다는 낫기야 하지만 이거 가지고 여행가려면 눈물이 앞을 가릴 지경.
아마도 이렇게 숏리드로만 구성된 생물 시퀀스는 시퀀싱 기술이 발전하고 (특히 단일 리드의 길이가 길어지면) 가격이 싸지는 경우 처음부터 다시 갈아엎지 않으면 안될 수준으로 보인다. 지금은 없는 것보다는 나으니까 쓰지만…
어쨌든 그러하다. 그렇게 오랜 세월 노력을 했음에도 불구하고 우리는 아직도 휴먼 지놈 시퀀스도 끝내지 못했다. 온갖 잡생물들의 시퀀스는 어련하랴?
앞으로도 시퀀싱 기술의 발전은 필요하다고 생각한다. 그러나 본 블로그 주인장의 견해로는 ‘그닥 훌륭하지 않은 퀄리티로 지놈을 싸게 뽑는 것’ 의 기술발전은 이만하면 되었다고 생각한다. 이제 생물학, 나아가서 바이오메디신의 발전을 위해서는 ‘지놈의 퀄리티’ 를 올리는 것이 필수적이며, 이를 위해서는 아마도 개별 read 의 길이가 늘어나는 것이 필수적이라고 생각한다.
물론 아직 STAP Cell 논문의 일부 혹은 전체에 어떤 과학적 진실이 담겨있는지는 확인되지 않았음. 그러나 상식적인 선에서 생각해 볼때,시약회사에서 파는 셀 사진을 자기 학위 논문의 데이터로 복붙하는 사람의 논문을 진지하게 믿기는 너무 힘들다라는 생각이 듬다. 그래서 일단 STAP Cell 논문들의 과학적 진실의 여부와는 상관없이, 해당 포스팅은 흑역사 처리합니다. 현재까지 확실히 드러난 문제에 대해서는 해당 포스팅에 업데이트합니다.
Q: 그 일본츠자가 한 일이 그리 대단한거냐?
A: 네. 조낸 대단합니다. 내가 살다 살다가 시약회사의 웹페이지 사진을 복붙해서 자기 데이터로 쓰는 사람이 있을 것이라는 것은 상상도 못했음.
일단 피아니스트는 에마뉴엘 엑스 (Emanuel Ax)라는 클래식 음악을 좀 들어봤으면 이름쯤은 들어봤을 네임드 피아니스트이다. 그런데 첼리스트? 웬 UCSF의 초파리 유전학자라고 한다. 웬 초파리 유전학자가 네임드 클래식 피아니스트와 같이 베토벤 첼로소나타를 켜는지? 음악시작하기 전에 둘이 떠드는 것을 보니 학교 동창이라는것 같다. 그러나 이 초파리 유전학자가 첼로를 잘 켜는 데에는 뭔가 이유가 있다. 사실은 알고보니 에마뉴엘 엑스와 같이 줄리어드 음대를 같이 다닌 동창생이라는 이야기를 한다. 그런데 왜 줄리어드 음대를 다닌 사람이 미국의 유명 연구중심대학인 UCSF에서 초파리 유전학을 연구하는가?
오늘 하게 될 이야기는 이 사람이 첼로를 버리고 생명과학 연구자가 된 연유이다.
이 사람의 이름은 톰 콘버그 (Thomas Kornberg). 음 근데 콘버그? 이름이 어째 친숙하네 하실 블로그 주인장과 동종업계인들이 계실 것이다. 사실 이 사람은 DNA Replication으로 유명하고 노벨상을 득템한 아서 콘버그(Arthur Kornberg, 1918-2007) 의 아들이자, 2006년 RNA Polymerase 구조규명으로 노벨상을 탄 로저 콘버그 (Roger Kornberg, 1947-) 의 동생이다. “아항” 하실 분들이 계실 것이다. “첼로켜다가 아빠하고 형이 잘나가니까 나도나도 하고 연구를 했구먼?” 이렇게 생각하실 것이다.
그러나 사정을 좀 더 뒤벼보면 이것보다 좀 더 재미있는 사정이 있으니..
이 이야기를 하기 위해서 잠깐 톰 콘버그의 아빠인 아서 콘버그의 이야기부터 해보도록 하자.
DNA라는 물질이 생체내에 있다는 것은 꽤 오래전부터 알려져 왔지만,뭐하는 듣보 물질인지 관심이 거의 없다가 1944년 혹시 DNA가 유전물질이 아닐까 하는 근거를 제시한 논문이 나왔으나 대부분의 생명과학자들에게는 아웃 오브 안중이었다. 그러나 왓&클의 DNA 이중나선 모델은 1953년에 나온 이후부터 DNA가 유전물질이고 어떻게 만들어지느냐에 대한 관심이 조금씩 올라가고 있었다. 이러던 와중에 1958년에 아서 콘버그 및 그 수하들은 대장균에서 어떤 효소를 발견하였는데, 이것이 DNA를 합성해 낸다는 증거를 확인한 게 저 논문이다.구체적으로 뭔 실험을 했는지는 요기를 참고
이렇게 해서 발견된 것이 바로 DNA Polymerase I 이고, 바로 다음해에 아서 콘버그는 스웨덴으로 직행. 논문 한편내고 다음해에 스웨덴가는 상당히 아스트랄한 상황이었지만 뭐 역시 사람은 때를 잘만나야 한다. ㅋ
비교적 젊은 나이에 노벨상을 득템한 아서 콘버그는 그 이후에도 DNA Polymerase 에 대한 연구를 계속하였고, 생화학적인 방법론으로 생체외 (시험관) 에서 DNA를 복제하기 위해서는 어떤 단백질들이 관여하냐 등등을 거의 대부분 규명하였다.
그러나 이 사람의 실험방법론은 거의 대부분 생화학적인 방법론, 즉 DNA 합성이라는 생화학 반응을 구성하는데 필요한 기질 및 효소들을 모두 정제하여 생체외 (시험관, In vitro) 내에서 재현하는 방법론에 의지하고 있었다. 따라서 다른 분야의 과학자, 특히 유전학자들로부터, ‘그래 너네가 발견한 효소로 시험관에서 DNA를 만들 수 있다는 것은 맞다고 쳐. 그렇지만 니가 발견한 효소가 과연 생물내에서 필요한 유전정보가 담겨있는 DNA를 복제하는 효소 맞아?“라는 의구심/공격을 받고 있었다.
이렇게 콘버그의 DNA Polymerase가 진짜 유전정보가 담겨있는 DNA를 복제하는 것인지에 대해서 의구심을 가진 사람들 중에 John Cairns 이라는 사람이 있었다. 이 사람은 콘버그의 DNA Polymerase는 유전정보가 담겨있는 DNA를 복제하는 효소가 아니라는 가설을 세웠다. 만약 이 가설이 맞는다면, 콘버그의 효소를 암호화하는 유전자에 영 좋지 못한 일이 생겨서 콘버그의 DNA Polymerase 를 만들지 못하더라도 대장균은 자라기는 자랄 것이라고 생각했다. 만약 콘버그의 효소가 유전정보를 복제하는 효소라면 그 유전자는 대장균의 생육에 꼭 필요로 하겠지.
John Cairns은 랩의 테크니션인 De Lucia 라는 사람을 시켜서 콘버그의 효소 유전자에 영 좋지 않은 일이 생긴 대장균 변이주를 분리하려고 했다. 이들이 돌연변이주를 찾는데 쓴 방법은 어떻게 보면 열라 무식한 방법인데..누군가를 저격하려면 그만큼의 노력이 필요하지 핫핫
1. 대장균에게 돌연변이원을 처리하여 생존한 균에서 수천개 콜로니를 따서 키워서 다 키워버려 ㅋㅋ
2. 각각의 변이주에서 콘버그가 기술한 방법대로 DNA Polymerase 활성을 측정
3. DNA Polymerase 활성이 안나오는 넘을 찾아라
그런 식으로 마침내 콘버그가 기술한 DNA Polymerase 활성이 야생형의 5% 미만인 변이주를 찾았다. DNA Polymerase 활성은 동위원소로 표지된 dNTP 가 존재하는 상태에서 DNA 를 만들고, 이걸 필터페이퍼에 가한 후 TCA 처리를 하면 핵산은 침전되어 필터페이퍼에 붙지만 남아있는 동위원소 표지 dNTP 는 워싱과정 중에서 없어지게 된다. 이렇게 워싱된 필터페이퍼를 Scintillation counter 에 넣고 방사능을 재면 간단히 DNA 를 얼마나 만드느냐를 측정가능하다. 아래 그래프에서 W의 경우 야생형, P의 경우 찾은 변이주의 조효소액을 넣고 활성을 측정한 결과. PW는 P에 W 1% 를 넣고 측정한 결과.
게다가 이 변이주는 야생형과 그닥 자라는게 차이가 없어! 그 이야기는 콘버그가 발견한 효소는 대장균이 자라는데 있어도 그만, 없어도 그만이라는 이야기이고 따라서 대장균의 유전물질을 복제하는 ‘바로 그 효소’ 가 아니라는 이야기. 이 변이주와 야생형 균주의 차이점은 자외선 처리 등 DNA 손상에 좀 더 민감하다는 정도(아마도 콘버그의 효소는 여기에 관여하는지도.) 그래서 이 논문은 1969년에 자연 잡지에 떡 하고 실렸다.
여튼 이런 논문이 발표되고 나서 많은 사람들은 ‘푸핫 저 아저씨는 지금까지 생명체에서 DNA 복제를 하지도 않은 효소가지고 그렇게 썰을 푼것임?ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ’ 하고 콘버그를 비웃공격하기 시작하였다. ‘DNA 폴리머레이즈라는게 있긴 있는거 맞아?’ 라는 이야기까지 나왔다.특히 그 당시에 네이처에서 최초로 만든 ‘자매지’ 인 Nature New Biology라는 잡지에서는 “DNA 폴리머레이지는 새빨간 거짓말” (Red herring) 이라고까지 무기명 기사를 통하여 칭하면서 디스하기 시작했다 우리 영국인은 무식한 양키는 까야제맛이라고 생각하죠
거의 콘버그는 10년전에 탄 노벨상을 게워네야 할 분위기. 그때 콘버그를 구원해 준 것은….
엉뚱하게도 미국 반대편 뉴욕에서 첼로켜던 둘째 아들이었다.
톰 콘버그는 자기 형 (Roger Kornberg)이 어려서부터 실험실에 들락거리며 연구를 하고, 학부때 과학을 전공한 것에 반하여 뉴욕의 콜롬비아 대학과 줄리어드 음대에 동시에 적을 두고 (이런게 가능한건지 모르겠지만 여튼 그렇댄다) 첼로 전공을 하고 있었다. 그런데 1970년, 손에 부상을 입게 되어서 당분간 첼로를 켤 수 없게 되었다. 아마 “쳇 첼로도 못키는데 이참에 생물학점이나 따자” 하고 콜롬비아 대학 강의를 듣고 있었다.
그런데 강의 중 (생화학? 아마) 강사가 대충 이런 멘트를 한 모양이다.
“너네들 DNA 폴리머레이즈라고 아냐? 10년 전쯤에 이걸 가지고 아서 콘버그라는 사람이 노벨상을 탔어. 그런데 얼마전에 그게 다 개구라라는게 밝혀졌거던? 콘버긐ㅋㅋㅋㅋㅋ 노벨상 다 게워내야됔ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ 콘버그가 엉뚱한 효소 가지고 생난리 치느라 우리는 진짜 DNA를 복제하는 효소가 아직도 뭔지도 몰랔ㅋㅋㅋㅋ”
강의를 듣고 있던 톰 콘버그는 당연히 빡쳤고, 아마도 “우리 아빠는 그렇지 않아!” 하고 외쳤을 것 같다.
아빠의 명예를 지키기 위해 강사에 강력히 항의하는 톰 콘버그.jpg (상상도)
그래서 생각한 것은 “흥 내가 아빠가 못찾은 DNA 폴리머레이즈, 내가 찾고만다” 하는 생각이었다. 첼로켜다 생화학 수업 듣던 학부생 나부랭이가 참으로 패기넘치는 생각을 했다고 생각했겠지만 이 사람은 실제로 콜롬비아 대학에 있는 어떤 교수(Malcolm L Gefter)의 연구실을 찾아가서 ‘새로운 DNA 폴리머레이즈를 찾고싶다’ 라는 계획을 이야기했다. “아마도 노벨상 수상자 아드님이 좀 심심하신가부다, 아참 이 사람 아빠한테 이 기회에 잘 보일 기회겠지?” 라는 생각이 들었는지는 모르겠지만 Gefter라는 사람은 톰 콘버그라는 학부생을 실험실에 받아주었다.
그리고 나서 1년이 안되서 그는 새로운 DNA 폴레머레이즈를 찾았다. 그것도 두 개나.
이 사람이 한 실험은 대체적으로 다음과 같다.
1. 이전에 분리된 ‘아빠 콘버그의 DNA Polymerase’ 가 작동하지 않는 돌연변이 대장균을 키워서 세포를 깨고, 진짜로 DNA Polymerase의 활성이 없는지를 조사하였다. 활성이 야생형 균주의 5% 로 줄어들긴 했지만 아주 약한 DNA 를 만드는 활성이 여전히 남아있다는 것을 확인하였다.
2. DNA Polymerase의 활성은 기존에 알려진 아빠 콘버그의 효소와 같은 것이고 단지 활성이 줄어든 것인가? 아니면 이와 별도로 활성을 가지는 별도의 효소가 있는 것인가를 확인하기 위하여 몇 가지 실험을 하여 1970년에 논문으로 보고하였다.
– 기존의 ‘콘버그 효소’ 는 높은 이온농도에도 활성이 있었지만 이 활성은 높은 이온농도에는 줄어든다.
– 기존의 ‘콘버그 효소’ 는 활성자리에 Free Cysteine의 thiol group (SH) 이 필요하다는 것이 알려져 있다. thiol group과 반응하는 4-Chloromercuribenzoic acid 를 쳐도 이 활성은 남아있다.
– 기존의 ‘콘버그 효소’ 를 인식하는 항체를 넣어도 이 활성에는 영향을 주지 않는다.
이렇게 ‘콘버그 효소’ 와 틀린 다른 DNA Polymerase가 대장균내에 있다는 확신을 가진 톰 콘버그는 이 효소활성을 순수정제를 시도하였다. 그래서 이런 논문을 1971년 발표하였다.
참고로 요즘은 단백질 하나 정제한다고 한다면 유전자 PCR로 떠서 어피니티 tag 붙이고, 대장균에서 과발현하여 어피니티 크로마토그래피로 대부분의 단백질을 거의 원, 투스텝으로 정제할 수 있는 시대이지만, 그땐 그딴 거 없었다. 그냥 어떤 단백질을 정제하기 위해서는 무작정 수십리터의 대장균을 키워서 활성을 찾아가는 노가다의 연속. 심지어 믿을랑가 모르겠지만 우리가 단백질 정제과정을 모니터링하는데 흔히 사용되는 SDS-PAGE 라는 테크닉 자체가 1970년에 처음 나온 것 이므로 대개의 경우 젤도 한번 걸지 못하고 오로지 효소의 활성과 활성이 얼마나 증가했는지만을 기준으로 단백질을 정제하는 시대였다. 그래서 그 당시에는 Purification Table 을 만들고 각각의 스텝별로 얼마나 효소의 특이활성 (단백질대 효소 활성)이 증가되었는지를 따지는 것이 정제정도를 판별하는 유일한 방법이었다.
이런 표 만들어 본 독자는 몇 분이나 계실까 모르겠다. 본 블로그 주인장은 해봤다. ㅋ
당시로서는 최신의 테크닉인 PAGE 를 이용한 단백질 순도검증 ㅋㅋㅋㅋ
그런데 단백질 정제과정 중에서 Phosphocellulose (Negative Charge를 띄고 Postive Charge를 띄는 단백질을 결합하므로 이것은 Cation Exchange Chromatography이다. 대개의 DNA Polymerase는 강한 Negative Charge를 띄는 DNA에 결합해야 하므로 Positive Charge를 띄는것이 보통이라는 것을 잊지말자) 컬럼에서 단백질을 분별해 보니 두개의 DNA Polymerase 활성이 나왔다. 즉 그 이야기는 최소 2가지 다른 DNA Polymerase가 있을 수 있다는 것이다.
그래서 이 활성이 dATP, dGTP, dCTP를 필요로 하고, 마그네슘이 필요로하고, DNA 가 필요로 한 전형적인 DNA Polymerase 이며, 기존 콘버그 효소를 인식하는 antiserium 을 넣어도 별 변화가 없는, 즉 기존 콘버그 효소와는 별도의 DNA Polymerase라는 것을 확인하였다.
자, 그렇다면 이 효소는 그동안 찾던 E.coli DNA 를 복제하는 ‘레알’ DNA Polymerase인가? 일단 이것을 확인하기 전에 두가지 서로 다른 DNA Polymerase 활성이 분리되었다는 것을 기억해 보자. 1972년 콘버그는 이 활성 중 또다른 하나를 정제하여 그 특성을 보아서 논문을 냈다. 자세한 내용은 생략. 뭐 또 다른 넘이 있다라는 이전 논문과 비슷한 내용
앞서 John Cairns의 결과는 ‘아빠콘버그 효소’ 가 없어도 E.coli 가 잘 자란다는 것을 보여주기 위해서 ‘아빠콘버그 효소’ 가 없는 E.coli 변이주를 찾았다. 만약 지금 발견한 두가지 효소 중에서 어떤 것이 E.coli 의 DNA 복제에 관여한다면, 이 효소가 없으면 아예 E.coli 는 자라지 못할 것이기 때문에 변이주를 만들수는 없을 것이다. 그렇다면 실험을 못하잖아 ㅠ.ㅠ
이렇게 건드리면 생물 자체를 완전히 죽여버리는 ‘필수적인’ 효소/유전자의 기능을 파악하는 꽁수로는 ‘일반 조건에서는 정상적으로 작동하지만 특정 조건에서는 불활성화되는’ 변이주를 찾는 것이다. 어떻게? 가령 E.coli 정상 생육조건보다 좀 더 높은 섭씨 41도에서는 잘 자라지 못하지만 섭씨 30도에서는 자라는 돌연변이주를 선별할 수 있다. (단백질이 불안정화되어 30도에서는 기능을 유지되지만 41도에서는 기능이 유지못하게 된다든지) 그래서 대략적으로 다음과 같은 방법으로 돌연변이주를 선발하였다.
(1) 박테리아에 돌연변이원을 처리해서 콜로니를 얻어!
(2) 그 다음에 이 콜로니를 그대로 카피를 뜹니다.
(3) 두개의 플레이트에 이걸 복사
(4) 한 플레이트는 30도에, 다른 플레이트는 41도에 두고, 30도에서는 자라지만 41도에서는 안 자라는 넘을 30도씨 플레이트에서 골라냄.
(5) 이렇게 골라낸 온도에 따라서 자랐다 안자랐다 하는 넘들 중 DNA 합성에 관련있는 넘들을 따로 골라냄. 뭐 자세하게는 이 논문 을 참고하고, 간단하게 이야기하자면 동위원소로 표지된 dNTP를 이용하여 동위원소가 DNA에 들어가는 정도로 선택을 함.
아무튼 저 위의 논문에서는 이렇게 발견된 DNA 합성에 관련된 온도감수성 돌연변이주를 John Cairns이 만든 돌연변이주(아빠콘버그 효소가 없는 균주)와 크로스해서 이중 돌연변이주를 만들고, 이들에서 DNA Polymerase 활성을 체크하였다.
여기서 A 패널은 John Cairns이 선별한 아빠콘버그 효소가 없는 균주. B패널은 야생형 균주. 세포의 단백질을 크로마토그래피로 분별하니 2개의 상이한 피크가 나오는데, A패널, 즉 아빠콘버그 효소 (Pol I) 이 없는 곳에서는 두 개의 피크가 나오고, B패널, 즉 Pol I 이 있는 곳에서는 첫번째 피크의 활성이 훨씬 크게 나온다. 즉 Pol I 은 Pol III (먼저 나오는 피크) 와 같은 위치에 있고 Pol II (나중에 나오는 피크)는 Pol III 과 다른 위치에 나오므로 두개의 활성을 서로 구분할 수 있다.
그래서 Pol III를 암호화하는 유전자를 찾기 위해서 각각의 이중 돌연변이주의 Pol II 와 Pol III 활성을 체크해보니
여기서 발견된 돌연변이주 중에서 dnaE 유전자에 돌연변이가 일어난 것만 30도에서는 활성이 있는데 41도에서는 완전히 Pol III 활성이 안나오는 것이 나옴. 반면 Pol II 는 그딴 거 없음.
즉 여기서 얻은 결론은
1. dnaE 유전자는 Pol III의 유전자이며
2. Pol III의 활성이 없으면 E.coli 는 자라지 않음.
3. 따라서 Pol III는 E.coli 의 복제에 필요한 레알 DNA Polymerase.
그래서 아빠 콘버그는 첼로켜던 아들의 객기 때문에 구라꾼이 될 위기를 면했고 (비록 Pol I 은 E.coli 생육에 필요한 것은 아니지만 대체적으로 Pol III와 DNA를 합성하는 특성은 유사하기 때문에) 아들 콘버그는 아마 이런 연구에의 성공 때문에 첼로는 그만두고, 1973년 E.coli DNA Polymerase 연구로 박사학위를 취득. 박사학위 취득 후에는 아마 아빠가 하던 거 계속하는 것은 좀 지겹다고 생각했는지 초파리 유전학으로 변신하여 현재 UCSF에서 실험실을 운영하고 있다는 이야기. 아빠나 형처럼 노벨상은 못 탔지만 여튼 유명한 과학자로써 일하고 있고 첼로는 아직도 취미로 가끔 켠단다. 친구인 에마뉴엘 엑스가 서부로 오면 같이 연주도 하고. (위의 인증동영상 참조)
우리가 PCR에 사용하는 Taq Polymerase 혹은 Pfu Polymerase는 다 이 효소의 사촌격인 셈. 가끔 PCR을 수행하면 Error 가 있는데 그렇다면 이 효소로 DNA 를 복제하는 Thermus 등의 균은 왜 DNA 정보를 그대로 유지해요? 하는 질문을 받을때가 있는데, 앞에서 말했듯이 DNA Pol I 은 생물의 DNA 복제에 사용되는 효소가 아니라 손상을 받았을때 수선하는데 사용하는 거다.
그러나 아들 콘버그가 발견한 DNA Polymerase, 즉 E.coli 의 지놈을 복제하는 ‘레알 DNA Polymerase’ 인 Pol III는 훨씬 복잡하게 생겼는데, 대략적으로 다음과 같이 여러개의 서브유니트로 구성된 효소이다.
dnaE 유전자는 실제 DNA Polymerase 의 촉매역할을 하는 alpha subunit에 해당. alpha subunit와 DNA는 대충 이렇게 붙는다.
즉 DNA Polymerase III를 구성하고 있는 개별 구성부품들의 구조는 대개 다 규명되어 있다. 그러나 톰 콘버그가 이 효소를 발견한지 어언 40년이 넘었는데도 DNA Polymerase III holoenzyme, 즉 E.coli DNA를 복제하는 이 정교한 기계의 완전한 구조는 아직 우리 손에 쥐어져 있지 않다. 구조생물학은 이제 할게 없다고?
업데이트 : 3월 10일, 이 논문의 공저자인 와카야마 테루히코가 다음과 같은 성명을 발표하였슴.
이 사람은 오보카타 하루코가 제공한 세포를 이용하여 Chimeric Mouse를 제작하여 해당 세포가 만능성을 가진다는 것을 보이는 결정적인 증거를 제공했는데, 여러가지 문제점이 지적되고 있는 상황에서 자신이 사용한 세포가 제대로 된 STAP 프로토콜에 의해서 만들어진 것인지가 의문이 들었음. 따라서 자신이 가지고 있는 ‘STAP 줄기세포’ 를 다른 연구기관에 제공하여 분석을 하여 과연 이 세포가 제대로 된 세포인지를 확인하여 공표하겠다고 함.
상황은 조금 시간이 지나봐야 알 수 있겠지만, 이 불로그 주인도 이 논문의 내용에 대해서 신뢰를 가지고 있던 이유라면 와카야마 테루히코가 이 연구에 참여하였다는 것이 주된 이유일텐데, 와카야마 자신이 이렇게 의구심을 가지게 된 상황에서는 이 연구가 과연 제대로 된 연구인지에 대해서 의심을 하지 않을 수 밖에 없슴다. 추후에 소식이 나오면 업데이트하겠슴.
논문이 리트렉트되거나 하는 경우에는 블로그 포스트도 리트렉트 -.-;;; 해야겠죠. 단. 포스트는 남겨두고 다 삭제표시 할것임다.
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약 한달 전쯤 STAP Cell 논문이 등장하고 나서 큰 파장을 일으켰고, 과연 이것이 다른 세포에도 가능할 것인가, 아니 과연 다른 사람들의 손에서 재현이 될 것인가와 같은 것이 화제로 떠올랐다. 한달이라는 짦은 시간을 생각하면 아직 결론을 내기는 이르지만, 흔히 사람들이 생각한 것처럼 “아무 세포나 30분간 pH5.4에 담가두면 존나 짱센 만능세포가 되요” 는 아닌 것 같다는 것이 대략적인 공감대인 것 같다.
그러나 많은 사람들이 간과하고 있는 것은 이것이다. 현재까지 보고된 ‘잘 안되염’ 의 경우 많은 조건이 오보카타 등이 사용한 조건과는 틀리다는 점이다. 즉 오보카타는 논문에 분명히 명시한 조건이 있는데 이것은 샘플을 채취한 것은 태어난지 1주일 된 쥐라는 점이다.
즉 처음에는 어른마우스의 세포를 가지고 실험을 했는데 잘 안되서 갓난마우스를 이용해서 하니 드디어 성공했다라는 이야기가 나온다. 즉 마우스의 나이가 중요하다라는게 바로 여기서 나오는데…
그러나 이런 것은 안보고 걍 사람, 래트, 늙은마우스, 젊은마우스, 이미 만들어진 셀라인 등 중구난방의 세포로 해봤는데 잘 안되더라라는 게 최근의 이야기이다. 그러나 오보카타와 동일한 조건의 갓난마우스를 가지고 했는데도 잘 안되더라 하는 보고는 없었다. 즉 지금까지 사람들이 ‘재현이 안된다’ 라고 한 것은 엄밀한 의미에서는 ‘재현실험’ 자체가 아닌 것이다. 즉 재현 실험이라면 가능한 원 실험자와 같은 조건으로 해서 성공을 하는 것이 첫번째 목표. 만약이 과정에서 제대로 되지 않는다면 원 실험자의 연구에 뭔가 문제가 있다는 것을 주장할수 있는 근거가 된다. 그러나 일단 중구난방의 조건에서 지 ㄲ리는대로 실험해놓고 ‘재현이 안된다’ 라고 주장하는 건 좀 그렇지 않을까?
결국 이러한 논쟁의 종지부를 찍기 위해서는 결국 오보카타와 그 동료들이 한 실험을 가능한 동일한 조건에서 재현할 수 있는지 없는지를 알아보는 것이 급선무가 될 것이다. 이를 위해서 리켄은 오늘 상세한 프로토콜을 공개했다.
원래는 논문 형태로 쓰려고 했는데 하도 지럴난리라서 빨리 공개한 것이라고..뭐 대충 뭐가 적혀있는지 보자.
뭐 내용을 자세히 소개해봐야 줄기세포 업자도 아닌 본 블로그 주인의 밑천만 뽀록날 것이겠지만 뭐 일단 키가 되는 것만 살펴보자.
시료준비
1. 태어난지 일주일되는 쥐를 잡아서 시료채취를 하는데
(i) Adherent cells should be dissociated into single cells, either mechanically or enzymatically (by trypsin or collagenase). For the tissues described in Fig.3a (Obokata et al. Nature, 2014a), muscle, adipose tissue and fibroblasts were enzymatically dissociated, whereas others were mechanically dissociated.
세포는 효소적 혹은 기계적인 방법으로 개별적으로 분리되어 있어야 되며
(ii) Primary cells should be used. We have found that it is difficult to reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEF) that have been expanded in vitro, while fresh MEF are competent.
바로 잡은 쥐에서 얻은 Primary Cell을 써야하며 많은 사람들이 ‘재현실험’ 에 쓴 Mouse embryonic fibroblast 셀라인은 리프로그래밍하기 어렵다고 함.
(iii) For the experiments reported, we used a Oct-3/4-EGFP transgenic mouse line (Ohbo et al, Dev Biol, 2003; Yoshimizu et al, Dev Growth Differ, 1999), which is maintained by the RIKEN Bioresource Center as GOF18-GFP line11 transgenic mouse (B6;B6D2-Tg(GOF18/EGFP)11/Rbrc). Homozygotes of the transgene were used for the live imaging to obtain the enhanced signal.
요런 마우스 라인을 썼으므로 재현실험할때는 바로 요넘을 먼저 가지고 시도를 하는게 중요함
(iv) Cells from mice older than one week showed very poor reprogramming efficiency under the current protocol. Cells from male animals showed higher efficiency than those from female.
어쩌면 가장 중요한 조건인데, 태어난지 1주 이상된 쥐에서 나온 셀에서는 현재의 조건에서는 리프로그래밍이 거의 안된다고 함. 그리고 수컷이 암컷보다 리프로그래밍 효율이 높다고 함
2. 그리고 세포의 순도면에서
(i) The purity of the starting cells is important for achieving STAP conversion. For lymphocytes, contamination with red blood cells may inhibit the reprogramming event. When using adherent cells, the presence of extracellular matrix may interfere with reprogramming.
임파구에서 STAP 셀을 만드는 경우 세포의 순도가 중요. 가령 적혈구가 섞여있다든지 그러면 저해된다나.
(ii) Alternatively, red blood cells may be removed by suspension of the cell pellet in 1.8 ml of H2O (Sigma W3500). After 30 seconds, add 0.2 ml of 10Å~ PBS (Gibco 70011-044), followed by 3 ml of 1Å~ PBS (Gibco 10010-023), and strain the cell suspension through a cell strainer.
혹은 이렇게 제거해도 되고
3. 가장 중요한 pH 처리
(i) The buffering action of HBSS is weak, so carry-over of the solution may affect pH. Please adjust pH to 5.7 in cell suspension by the following method. First, suspend the cell pellet with 494 μl of HBSS pre-chilled at 4°C, then add 6 μl of diluted HCl (10 μl of 35% HCl in 590 μl of HBSS) to adjust to a final pH of 5.7. Please confirm the final pH in a pilot experiment, and optimize the volume of HCl added, as necessary. Alternatively, suspend the cell pellet in HBSS-pH 5.4 pre-chilled at 4°C.
사용된 버퍼의 pH유지능이 낮기 때문에 약간 딸려나온 국물(?)만으로 pH가 5.7에서 벗어날 수 있으므로 pH 위처럼 잘맞춰라
(ii) The HBSS we used is Ca2+/Mg2+ free (Gibco 14170-112).
(iii) Incubate the cells suspended in HBSS in a CO2 incubator.
(iv) Cell viability is a critical parameter in this step. Under optimal conditions, massive cell death is observed at two days after plating, as shown in Figure 1d (Obokata et al. Nature, 2014a).
컬춰한지 2틀째부터 세포가 죽어나가는게 키 ㅋ
(v) If you find massive cell death at one day after plating, it may be ameliorated by shortening the incubation period with low-pH HBSS solution to 15 min.
첫날부터 셀이 죽어나가면 pH 처리를 15분간만
여튼 꽤 자세한 프로토콜이 첨부되어 있으므로 도전해볼 분들이라면 해보시길. 아마 키포인트는 1주안된 새끼쥐사용, pH 처리하는 과정 등인듯. 그래도 안되면 뭐 리켄 앞에서 연좌농성이라도..ㅋㅋ
어쨌든 이제 모든 노하우 (더 있는것인지는 모르지만 ㅋ) 를 털어놓은 셈이니 문제는 이 방법 그대로 하면 만능세포가 나오냐, 안나오냐, 나온다면 얼마나 쉽게 나오냐가 관건일 것임네다. 그 다음에 과연 이게 쓸모있느냐, 어린쥐만 되면 사람은 안되느냐, 늙으면 죽어야함? 뭐 이런문제들은 나중에 천천히 생각해 보자고들..
그리고 아직 논문 나온지 한달밖에 안 되었다. 만약 실험을 하는 이분야 업자들이라면..님은 논문에 나온 새로운 프로토콜 한달안에 셋업해서 해본 경험이 얼마나 있는지부터 한번 곰곰히 생각해 보실것. 남의 실험 혹은 테크닉을 내가 재현하려면 시간이 필요하고 이 테크닉을 보다 재현성있고 적용범위가 넒은 것으로 만드는 것은 바로 줄기세포 하시는 업자님들이 하실 일. 날로먹는거넘좋아하면비브리오균이
Secret Lab of a Mad Scientist 
