도로시 호지킨 (Dorothy Hodgkins)

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며칠 전 (2014년 5월 12일) 구글 두들에는 이런 것이 올라왔음. 이게 뭘까? 오늘은 영국의 화학자인 도로시 호지킨 (Dorothy Hodkins, 1910-1994) 의 탄생일이다. 단백질 결정학을 주요 연구도구중의 하나로 사용하고 있는 사람으로써, 내가 사용하는 툴의 기틀을 닦은 양반에 대해서 뭔가 써야 할 의무감을 느껴서.

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1. 굇수

구조생물학을 하는 사람에게 있어서 가장 중요한 업적이라면? 당연히 생체물질의 구조를 규명하는 일이다. 구조를 규명한다면 기왕이면 생물학적으로 중요한 구조면 더욱 좋겠지? 평생 하나의 중요한 생체물질의 구조 정도만을 규명해도 이 바닥에서 “우와 무슨 무슨 구조를 푼 누구누구 짱짱맨~” 소리를 듣는다. 그러나 이 양반은 다음과 같은 구조를 혼자서 푸신 양반이다. 더 중요한 것은 이 양반이 이렇게 복잡한 화학물질의 구조를 X선 결정학을 이용하여 풀기 전까지는 그런 것이 가능하다라고 생각하지조차 못했다는 사실.

– 페니실린 G (1945)

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20세기 중반만 하더라도 X선 결정학은 일부 물리학자들이나 가지고 노는 실험방법이라고 간주되었고, 이것을 이용하여 복잡한 화학물질의 구조를 규명하는 것은 어불성실이라고 생각했던 모양이다. 도로시 호지킨이 X선 결정법에 의해서 베타락탐링을 가지는 페니실린의 구조를 발표했을때 이것이 그대로 받아들여지지 않았다. 이러한 구조는 너무 불안정해서 자연계에 존재할 수 없다나.. John Cornforth라는 사람은 심지어 이렇게 말했다고. “ㅋㅋ 저게 페니실린의 구조라면 난 걍 화학을 관두고 버섯이나 키울란다 ㅋㅋㅋㅋㅋ”  If that’s the formula of penicillin, I’ll give up chemistry and grow mushrooms”

그러나 도로시 눈화의 그 구조는 맞아버렸고, 뻔뻔스럽게도 ‘버섯가이’ 는 자기의 호언장담은 입싹씻고 그냥 화학연구를 계속했다. 독버섯은 기억상실증을 유도할수도 있습니다 연구하다가 심심했는지 도로시 눈화가 갔다온 10주년 기념으로 1975년 스웨덴에 관광도 가기도 하고.

비타민 B12 (1954)

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이런 업적때문에 이 양반은 1964년 스웨덴에 갔다오셨다. 참고로 여성으로 노벨 화학상을 받은 것은 마리 퀴리와 그 딸 이레느 퀴리 이후 세번째. 즉 이름에 ‘퀴리’ 가 안 들어간 분으로는 최초라는 이야기다.

그런데 보통 노벨상 받은분들이면 걍 이제 퍼져노셔도 연구의 일선에서 떠나기 마련이지만 이 양반은 그 이후에도 연구에 전념.그리하여,

인슐린 (1969년)

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즉 이 양반은 한개를 풀어도 오오 스웨덴 어서오세염~ 할만한 일을 3인분을 하셨다는. 게다가 그 당시는 요즘처럼 결정을 만들면 슥 올려놓으면 자동으로 수백장의 데이터를 모아주고 자동적으로 회절이미지를 분석해주던 시기도 아니고, 결정 하나에 엑스레이 사진 한장 꽝 찍고, 그리고 이걸 디벨로퍼와 픽서를 가지고 현상~ 이걸 수백번 반복.  현상한 필름에서 나온 점들의 위치를 재고….등등을 반복하여 일일히 복잡한 계산을 하던 시가라는 것을 생각하면 더욱 ㅎㄷㄷ

2. 사회운동가

과학자로써도 초일류의 사람이었으나, 이 사람은 정치사회적 문제에 대해서 꽤 앞장서 발언을 하는 사람으로 유명했었다. 아마도 그 이유로는 이 사람의 멘터인 존 데스먼드 버날의 영향이었을 것이다. 이 사람은 X선 결정학의 발전과정에서 결정적인 공헌을 한 것으로도 유명하지만 정치적인 활동으로도 유명한 사람.

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로절린드 프랭클린을 Birbeck College로 스카우트해간 사람도 이사람.

여튼 도로시 호지킨은 남편인 라이오넬 호지킨과 함께 여러가지 사회정치적인 활동을 했는데, 객관적으로 볼때 좌파라고 볼 수 있는 스탠스를 가진 양반이었다. 소련쉴드 Pugwash conferences on Science and World Affairs 라는 세계평화를 위한 학자 단체의 회장도 오래하시고.

3. 멘터
그런데 도로시 호지킨은 옥스포드대학에서 있을때 학부생들을 데리고 일을 많이 했었음. 성품이 괜찮으신 듯해서 많은 학생들이 따랐다고 함. 이중 마거릿 로버츠 (Margaret Hilda Roberts) 라는 학생이 있었는데, 이 학생은 1947년 학부 4학년때 도로시 호지킨의 지도하에 그라미디신 (Gramidicin)이라는 항생제의  결정 실험을 하고 이것으로 학사 졸업논문을 썼다고 함 그리고 학부 졸업한 후 전공 살려 취직했음.그런데 이 학생은 연구직에 얼마 안 있고, 새로운 진로를 모색하게 되는데..그게 바로 정치. 그리고 결혼한 후 남편 성을 따랐음.

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요 사람이 장차

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Margaret Thatcher 이 됩니다.

정치적으로는 좌파라고 볼 수 있는 도로시 호지킨의 제자가 신자유주의의 화신과 같은 마거릿 대처라는 사실은 참 아이러니칼한 일이지만, 이러한 정치노선의 차이에도 불구하고 마거릿 대처는 도로시 호지킨의 밑에서 연구를 했다는 것을 자랑스럽게 여겼다고. 또한, 이학사를 가진 최초의 영국수상이라는 사실에 대해 최초의 여자수상이라는 것보다도 저 자랑스럽게 여겼다나. 이것은 이과부심…보다 정확히 말하지면 N모상 수상자 제자부심? ㅎ

공학사를 가진 최초의 한국대통령은 Carbon dioxide를 ‘이산화가스’ 라고 이야기하시지만...뭐 전자과라서 그렇다고 하고…그렇다면 전자기학이 출동하면 어떨까?

게다가 이 사람의 경우 실제로 학생으로, 그리고 회사의 연구원으로 연구를 해 본 경험에 의해서 과학 연구에 대해서는 실제로 연구를 하는 과학자들이 제일 잘 판단할 수 있다 라는 믿음을 정치가가 되서도 버리지 않았다고 함. 그전까지 영국의 과학 정책은 소위 ‘Haldane Principle’, 즉 어떤 연구에 얼마나 투자할지는 관료가 아닌 실제 연구를 하는 과학자가 결정해야 한다는 1917년의 원칙에 의해 움직이고 있었지만 1970년, 이러한 영국의 과학정책을 수정하여 보다 시장중심적으로 바꾸어야 한다는 주장이 있었다고 함. 그때 이러한 제안에 (흔히 ‘시장주의의 화신’ 이라고 생각되던 이미지와는 달리) 동의하지 않고 과학은 과학자에게 맡겨두어야 한다는 소신을 마거릿 대처는 잃지 않았다고 함. 아마 이것도 어느정도는 마거릿 대처에게 ‘과학이란 어떤 것이다’ 를 보여줬던 도로시 호지킨의 덕일지도.

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CRISPR/Cas9 101

본 블로그에서 이전에 소개했던 글에 대한 프레젠테이션화 자료되겠음. 잘 아시다시피 본 블로그 주인장은 지놈 엔지니어링 전문가가 아니므로 (언제 전문가여서 논읽냠 하겠냐만) 어디까지나 “허구연 해설위원이 중계하는 김연아 피겨경기” 정도의 깊이를 가진 자료라는 것을 상기하시기 바라며 언제 식샤나 한번

ppt 발표자료를 웹에서 공개할때 보통 slideshare.com 등을 써 왔는데, Powerpoint Online 이 더 나은듯 함. 일단 모든 Animation이 제대로 워킹하고(애니메이션 단계별로 넘어갈때는 슬라이드 내부 클릭), 임베딩한 동영상까지 그대로 재생됨!

연휴의 논읽남 : 정자와 난자가 만날 때

웬 19금스러운 제목인가 싶겠지만, 논읽남입니다. 논읽남 오늘 읽어볼 논문은 이거.

Bianchi et al, Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization,  Nature 2014

정자와 난자가 만날 때 

어느 성교육 시간

얼라 “샘..아기는 어떻게 생기죠?”

샘 (쭈빗쭈빗) “아빠의 정자와 엄마의 난자가 만나서 둘이 합쳐지면…”

물론 아빠 몸 속에 있는 아빠의 정자가 엄마 몸 속에 있을 엄마의 난자가 어떻게 같은 위치에 있게 되느냐에 대한 구체적인 기작에 대해서 설명하는 게 순서겠지만 ;;; 이 부분을 어떻게 얼라들에게 설명하실지는 논읽남이 어떻게 할 일은 아니라고 생각해염. 

그런데 아빠의 정자와 엄마의 난자만 딱 있는 상황 (예:세포외수정 In vitro fertillization) 이라면 모르겠지만 아빠의 정자가 엄마의 난자를 만나기까지는 수많은 다른 세포와 스쳐지나가게 된다. 하다못해 난자에 근접한 이후에도 문제인데, 난자는 흔히 보듯이 난자만 덜렁 있는 것이 아니라 cumulus cell 이라는 세포층에 둘러싸여져 있는데, 정자는 이를 비집고 들어가서 난자를 둘러싸고 있는 ‘투명대’ (Zona pellucida)라는 단백질층을 관통해서 난자와 세포융합을 실시한다. 다른 세포는 하나도 건드리지 않고 말이다어떻게?

게다가 일단 난자에 골인~ 한 정자는 다른 정자가 들어오지 못하도록 세포막과 Zona pellucida 단백질층을 변형시켜 뒤늦게 현장에 출몰한 정자들의 침입을 원천봉쇄한다.

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즉 정자는 마치 자석에 끌리듯 난자를 찾아가서, 난자의 투명대와 세포막을 뚫고 들어가서 난자에만 융합을 하게 된다. 게다가 이 융합의 경우는 종 특이적으로써, 당연히 쥐 정자는 사람 난자를 뚫고 들어가 수정을 할 수 없으며 그 반대도 마찬가지이다. 어떻게??

정자와 난자에는 타겟인 난자를 인식하는 열쇠와 열쇠구멍에 상응하는 것이 있으며, 좀 더 생화학적으로 이야기하자면 정자 표면에 있는 ‘어떤 생체분자가’ 난자의 세포막 위에 있는 ‘어떤 생체분자’ 과 특이적으로 결합을 해야 할 것이다. 대개 이 ‘생체분자’ 는 단백질이라고 생각하는게 보통이겠고..

그러면 그게 뭔데?

가 오늘의 논읽남 주제.

Izumo

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 한 10년 전에 정자 표면에 Izumo 라는 단백질이 존재하고, 이 단백질이 정자가 난자를 인지하는데 특이적인 ‘열쇠’ 로 작용하는 것이 확인되었다. 즉 이 유전자가 낙아웃된 쥐에서 나온 정자는 난자에 못 들어가고 당연히 불임.  난자가 저기 있는데 왜 합체를 못하니

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그렇다면 정자 표면 위에 존재하는 Izumo라는 단백질은 어떤 단백질인가? Immunogloblin하고 비슷하게 생긴 막 단백질.

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원래는 이 단백질이 기존에 난자표면에 존재하는 단백질이고, 이것이 없으면 불임이 유발되는 단백질인 CD9 이라는 단백질과 서로 상호관계인줄 알았다. 그러나 그렇지 않았다. 그렇다면 Izumo와 서로 작용하여 정자를 난자내로 들여보내는 단백질은 과연 무엇일까? 그게 약 10년 동안 찾아지지 않았다.

짚신의 짝을 찾는 방법

생체내에서의 많은 생명현상은 단백질간의 상호작용 (Protein-Protein Interaction) 에 의해서 일어나는 경우가 허다하고, 어떠한 단백질이 어떤 생명현상에 관여한다는 것이 발견되면, 다음 과제는 이 단백질과 상호작용을 하는 단백질이 어떤 것일까인지를 아는 것이다. 그렇다면 이런 단백질을 찾으려면 어떻게 해야하나?

흔히 단백질 상호작용을 찾을때 많이 사용되는 유전적인 방법으로는 “Yeast two-hybrid” 와 같은 시스템이 있고, 생화학적인 방법론으로는 GST pulldown 혹은 immunoprecipitation 등에 의해서 같이 딸려나오는 단백질을 프로테오믹스적인 방법으로 확인하여 찾는 등의 방법이 있을 수 있겠다. 그러나 본 논문에서는 이런 방법이 아닌 조금은 색다른 방법에 의해서 Imuzo 의 파트너를 찾게 되었다. 물론 해당 연구자들도 기존에 잘 알려진 방법들을 먼저 시도해 봤겠지. 그러나 그런게 안되니 10년동안 그 파트너를 발견하지 못한 것이겠고 ㅋㅋ  몇 가지 문제가 있었는데, 결합력이 많이 낮았고, 특히 Pulldown과 같은 방법으로 단백질을 분리하기에는 난자라는 샘플은 그닥 양이 충분하지 못해서 쿨럭..

여튼 이 사람들은 Izumo의 ectodomain만을 HEK293T 세포에서 발현하여 이것을 일종의 Probe로 사용하기로 하였다. 단, 단백질의 리셉터에 대한 결합력을 늘리기 위하여 단백질을 pentamer로 만드는 도메인과 fusion 한 단백질을 만들었고 뒤에 디텍션을 위한 FLAG tag, 정제를 위한 His tag을 달았다.

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그래서 이 단백질 프로브를 난자에  Immunostaining하듯 붙이고 Anti-FLAG 으로 염색해 보니 난자의 세포막에 슥~ izumo 단백질이 달라붙는 것을 알 수 있었다.

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그러나 HEK293T 세포 등과 같이 Izumo 리셉터 가 없는 세포에는 당연히 Izumo 단백질은 붙지 않는다.

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요런 성질을 이용하여 Izumo 단백질에 붙는 유전자를 클로닝하기 위해서 Expression cloning방법을 시도하였다.  이전에 80-90년대에 미지의 유전자를 찾을때는  많이 사용하던 방법이었는데지놈 시대에  넘의 Expression Cloning 이냐 생각하겠지만나중에 보면 알겠지만 시퀀스 호몰로지만으로 모든 유전자를 찾을 수는 없는거란다 얼라들야..

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마우스 난자 유래의 expression cDNA 라이브러리를 일단 대장균에 형질전환한후 한 플레이트에 약 100개 정도의 콜로니 (각각 다른 유전자가 들어있을) 가 나오게 깔고 이것을 360 플레이트를 깔았다. 그 다음에 플레이트에 있는 박테리아를 몽땅 합쳐서 플라스미드를  뽑음. 그러면 대충 랜덤하게 100개 정도씩의 클론이 합쳐진 풀이 360개 정도 나오겠지?  뭐 삼빡하게 360개 미니프랩 하면 됩니다 

그래서 약 360종류의 풀링된 플라스미드를 각각 HEK293 세포에 형질전환. 그 다음에 Izumo 단백질 깔고, Izumo 단백질이 멤브레인에 붙어있는지를 Immunostaining으로 디텍션.  그중 하나의 Pool에서 시그널이 나오는 넘이 잡힘.

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(약 100개 정도의 클론이 들어있을) 64번 Pool 을 다시 대장균에 형질전환해서 나오는 콜로니를 다 미니프랩 ㅋ

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그걸 다시 12개씩 썪어서 그룹별로 테스트.

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12개중 B2라는 넘이 당첨! 시퀀싱을 해보니

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기존에 folic acid receptor 로 알려졌던 유전자의 homolog로 db에 등록되어 있던 넘이다. (Folr4로 등록됨) 근데 시퀀스를 살펴보니 Folic acid 의 결합에 필요한 보존된 서열 중 몇개가 이가 빠져 있음. 그리고 folic acid 결합력을 조사해 보니,

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안붙음 ㅋ 이건 folic acid receptor 가 아님. 그래서 새로운 이름을 지었음. Juno. 이걸 보면서 느끼는 게 뭐 없으신지? 지놈 시퀀싱을 통해서 많은 유전자들의 기능이 단지 단백질 상동성만으로 무슨 단백질이라고 추측되곤 하는데 (생화학적인 분석도 없이) 이게 꼭 정확하지 않을수도 있다는 이야기지..

Juno

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여튼, 이 Juno라는 단백질에 대한 항체를 만들어 보니 난자의 세포막에 왕창 존재하는 것을 알 수 있었음.

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Juno 대한 항체를 처리하면 Izumo1 probe 난자의 막에 더이상 붙지 않음 Juno 항체가 Izumo1 Juno 상호작용을 블락한다는 이야기임

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정제된 Izumo와 Juno는 서로 상호작용을 (약하게) 하며(A) 시퀀스가 유사한 Folic acid receptor 들은 Izumo 와 상호작용을 하지 못하며 (B) 사람, 쥐, 돼지 등 포유류에서 Izumo와 Juno는 동일하게 상호작용을 한다는 이야기. 즉 포유류에서는 보존된 기작이라는 말씀

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그렇다면  단백질 간의 상호작용을 방해하면 난자와 정자가 수정되는 것을 방해할  있는가

마우스 정자와 난자 섞고 체외수정을 시도할때 Izumo Juno 항체를 넣어주면 수정 안됨

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낙아웃 쥐를 만들어 보니 Juno 유전자가 homozygote knockout   쥐는 새끼 못 낳음. 

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Juno (-/-) 쥐의 난자와 정자가 만나면 어떻게 되나 살펴보니 정자가 투명대는 통과하지만 투명대와 난자 사이의 공간인 위란강 (Perivitelline space) 에 정자가 몰려있음.  표면에 Juno 없는 난자는 정자가 뚫고들어갈  읍슴. 고지가 저기인데 왜 깃발을 못 꽂니

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못 뚫고 간다니까요

즉 Izumo 와 Juno의 상호작용은 정자가 수정후에 난자의 막을 뚫고들어가는 필수요소라는것이 입증되었다.  그런데 여기서 한가지. 수억마리의 정자가 난자로 비집고 들어가지만, 골인을 하는 넘은 딱 한마리. 일단 한마리가 골인을 한 다음에는 난자의 세포막에 ‘어떤’ 변화가 생겨서 더 이상 정자가 뚫고들어올수는 없게 된다. 그게 어떻게 일어나는가?  바로 여기서 밝혀진 Juno가 이 현상 (Cortical Reaction 이라고들 한다) 의 중심이 되는 단백질이라는 것이 밝혀졌다.

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 성숙된 난자 (Metaphase II) 에서는 Juno 세포막에 잔뜩 존재하지만수정 직후에 Juno 스르르 사라지며수정이 일어나면 완전히 세포막에서 사라지게 되고따라서 추가로 들어오는 정자의 침입을 원천봉쇄 

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EM 찍어보니까수정이 되면 Juno (쩜쩜으로 표시된 것들 세포막에서 스르르 덤프되서 방출된다는  확인됨 

 

그래서 어쩌라고

여기서 발견된 두개의 단백질의 상호작용은 꽤 의미가 있는데, 일단 해당 단백질이 수정과정에서 핵심적인 역할을 한다는 것이 알려졌으므로 불임 진단 등에서 꽤 유용하게 사용될 것이다. 단, 이 경우에는 단지 정자가 난자의 막을 뚫지 못한다는 것 뿐이므로 정자를 미세조작기로 찝어서 난자안에 찔러넣는 기술인 Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) 를 이용하면 정상적인 수정이 가능하므로 큰 문제는 되지 않을 것이다.

보다 더 재미있을 응용이라면 해당 단백질간의 상호작용을 방해하는 small molecule inhibitor 라든지 이런게 있다면 이것은 수정 과정을 직접적으로 막는 신개념 피임제제로 응용될 수도 있지 않을까. 물론 이를 위해서는 Juno – Izumo간의 단백질 결합구조를 규명하는 것도 필요할 것 같고…아니면 말고.

오카모토(주) 사장님이 이 논문을 싫어합니다