[흑역사] STAP Cell을 만드는 상세한 프로토콜

업데이트 : 3월 10일, 이 논문의 공저자인 와카야마 테루히코가 다음과 같은 성명을 발표하였슴. 

이 사람은 오보카타 하루코가 제공한 세포를 이용하여  Chimeric Mouse를 제작하여 해당 세포가 만능성을 가진다는 것을 보이는 결정적인 증거를 제공했는데, 여러가지 문제점이 지적되고 있는 상황에서 자신이 사용한 세포가 제대로 된 STAP 프로토콜에 의해서 만들어진 것인지가 의문이 들었음. 따라서 자신이 가지고 있는 ‘STAP 줄기세포’ 를 다른 연구기관에 제공하여 분석을 하여 과연 이 세포가 제대로 된 세포인지를 확인하여 공표하겠다고 함.

그리고 Wall Street Journal 에 따르면 와카야마 테루히코는 네이처에 논문의 철회를 요청하였다고.

상황은 조금 시간이 지나봐야 알 수 있겠지만, 이 불로그 주인도 이 논문의 내용에 대해서 신뢰를 가지고 있던 이유라면 와카야마 테루히코가 이 연구에 참여하였다는 것이 주된 이유일텐데, 와카야마 자신이 이렇게 의구심을 가지게 된 상황에서는 이 연구가 과연 제대로 된 연구인지에 대해서 의심을 하지 않을 수 밖에 없슴다. 추후에 소식이 나오면 업데이트하겠슴.

논문이  리트렉트되거나 하는 경우에는 블로그 포스트도 리트렉트 -.-;;; 해야겠죠. 단. 포스트는 남겨두고 다 삭제표시 할것임다.

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약 한달 전쯤 STAP Cell 논문이 등장하고 나서 큰 파장을 일으켰고, 과연 이것이 다른 세포에도 가능할 것인가, 아니 과연 다른 사람들의 손에서 재현이 될 것인가와 같은 것이 화제로 떠올랐다. 한달이라는 짦은 시간을 생각하면 아직 결론을 내기는 이르지만, 흔히 사람들이 생각한 것처럼 “아무 세포나 30분간 pH5.4에 담가두면 존나 짱센 만능세포가 되요” 는 아닌 것 같다는 것이 대략적인 공감대인 것 같다.

그러나 많은 사람들이 간과하고 있는 것은 이것이다. 현재까지 보고된 ‘잘 안되염’ 의 경우 많은 조건이 오보카타 등이 사용한 조건과는 틀리다는 점이다. 즉 오보카타는 논문에 분명히 명시한 조건이 있는데 이것은 샘플을 채취한 것은 태어난지 1주일 된 쥐라는 점이다.

그리고 이 논문이 처음 나왔을때 나온 네이처의 요 기사를 잘 읽어보면

즉 처음에는 어른마우스의 세포를 가지고 실험을 했는데 잘 안되서 갓난마우스를 이용해서 하니 드디어 성공했다라는 이야기가 나온다. 즉 마우스의 나이가 중요하다라는게 바로 여기서 나오는데…

그러나 이런 것은 안보고 걍 사람, 래트, 늙은마우스, 젊은마우스, 이미 만들어진 셀라인 등 중구난방의 세포로 해봤는데 잘 안되더라라는 게 최근의 이야기이다. 그러나 오보카타와 동일한 조건의 갓난마우스를 가지고 했는데도 잘 안되더라 하는 보고는 없었다. 즉 지금까지 사람들이 ‘재현이 안된다’ 라고 한 것은 엄밀한 의미에서는 ‘재현실험’ 자체가 아닌 것이다. 즉 재현 실험이라면 가능한 원 실험자와 같은 조건으로 해서 성공을 하는 것이 첫번째 목표. 만약  이 과정에서 제대로 되지 않는다면 원 실험자의 연구에 뭔가 문제가 있다는 것을 주장할수 있는 근거가 된다. 그러나 일단 중구난방의 조건에서 지 ㄲ리는대로 실험해놓고 ‘재현이 안된다’ 라고 주장하는 건 좀 그렇지 않을까?

결국 이러한 논쟁의 종지부를 찍기 위해서는 결국 오보카타와 그 동료들이 한 실험을 가능한 동일한 조건에서 재현할 수 있는지 없는지를 알아보는 것이 급선무가 될 것이다. 이를 위해서 리켄은 오늘 상세한 프로토콜을 공개했다.

프로토콜

원래는 논문 형태로 쓰려고 했는데 하도 지럴난리라서 빨리 공개한 것이라고..뭐 대충 뭐가 적혀있는지 보자.

뭐 내용을 자세히 소개해봐야 줄기세포 업자도 아닌 본 블로그 주인의 밑천만 뽀록날 것이겠지만 뭐 일단 키가 되는 것만 살펴보자.

시료준비

1. 태어난지 일주일되는 쥐를 잡아서 시료채취를 하는데

(i) Adherent cells should be dissociated into single cells, either mechanically or enzymatically (by trypsin or collagenase). For the tissues described in Fig.3a (Obokata et al. Nature, 2014a), muscle, adipose tissue and fibroblasts were enzymatically dissociated, whereas others were mechanically dissociated.

세포는 효소적 혹은 기계적인 방법으로 개별적으로 분리되어 있어야 되며

(ii) Primary cells should be used. We have found that it is difficult to reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEF) that have been expanded in vitro, while fresh MEF are competent.

바로 잡은 쥐에서 얻은 Primary Cell을 써야하며 많은 사람들이 ‘재현실험’ 에 쓴 Mouse embryonic fibroblast 셀라인은 리프로그래밍하기 어렵다고 함.

(iii) For the experiments reported, we used a Oct-3/4-EGFP transgenic mouse line (Ohbo et al, Dev Biol, 2003; Yoshimizu et al, Dev Growth Differ, 1999), which is maintained by the RIKEN Bioresource Center as GOF18-GFP line11 transgenic mouse (B6;B6D2-Tg(GOF18/EGFP)11/Rbrc). Homozygotes of the transgene were used for the live imaging to obtain the enhanced signal.

요런 마우스 라인을 썼으므로 재현실험할때는 바로 요넘을 먼저 가지고 시도를 하는게 중요함

(iv) Cells from mice older than one week showed very poor reprogramming efficiency under the current protocol. Cells from male animals showed higher efficiency than those from female.

어쩌면 가장 중요한 조건인데, 태어난지 1주 이상된 쥐에서 나온 셀에서는 현재의 조건에서는 리프로그래밍이 거의 안된다고 함. 그리고 수컷이 암컷보다 리프로그래밍 효율이 높다고 함

2. 그리고 세포의 순도면에서

(i) The purity of the starting cells is important for achieving STAP conversion. For lymphocytes, contamination with red blood cells may inhibit the reprogramming event. When using adherent cells, the presence of extracellular matrix may interfere with reprogramming.

임파구에서 STAP 셀을 만드는 경우 세포의 순도가 중요. 가령 적혈구가 섞여있다든지 그러면 저해된다나.

(ii) Alternatively, red blood cells may be removed by suspension of the cell pellet in 1.8 ml of H2O (Sigma W3500). After 30 seconds, add 0.2 ml of 10Å~ PBS (Gibco 70011-044), followed by 3 ml of 1Å~ PBS (Gibco 10010-023), and strain the cell suspension through a cell strainer.

혹은 이렇게 제거해도 되고

3. 가장 중요한 pH 처리

(i) The buffering action of HBSS is weak, so carry-over of the solution may affect pH. Please adjust pH to 5.7 in cell suspension by the following method. First, suspend the cell pellet with 494 μl of HBSS pre-chilled at 4°C, then add 6 μl of diluted HCl (10 μl of 35% HCl in 590 μl of HBSS) to adjust to a final pH of 5.7. Please confirm the final pH in a pilot experiment, and optimize the volume of HCl added, as necessary. Alternatively, suspend the cell pellet in HBSS-pH 5.4 pre-chilled at 4°C.

사용된 버퍼의 pH유지능이 낮기 때문에 약간 딸려나온 국물(?)만으로 pH가 5.7에서 벗어날 수 있으므로 pH 위처럼 잘맞춰라

(ii) The HBSS we used is Ca2+/Mg2+ free (Gibco 14170-112).

(iii) Incubate the cells suspended in HBSS in a CO2 incubator.

(iv) Cell viability is a critical parameter in this step. Under optimal conditions, massive cell death is observed at two days after plating, as shown in Figure 1d (Obokata et al. Nature, 2014a).

컬춰한지 2틀째부터 세포가 죽어나가는게 키 ㅋ

(v) If you find massive cell death at one day after plating, it may be ameliorated by shortening the incubation period with low-pH HBSS solution to 15 min.

첫날부터 셀이 죽어나가면 pH 처리를 15분간만

여튼 꽤 자세한 프로토콜이 첨부되어 있으므로 도전해볼 분들이라면 해보시길. 아마 키포인트는 1주안된 새끼쥐사용, pH 처리하는 과정 등인듯. 그래도 안되면 뭐 리켄 앞에서 연좌농성이라도..ㅋㅋ

어쨌든 이제 모든 노하우 (더 있는것인지는 모르지만 ㅋ) 를 털어놓은 셈이니 문제는 이 방법 그대로 하면 만능세포가 나오냐, 안나오냐, 나온다면 얼마나 쉽게 나오냐가 관건일 것임네다. 그 다음에 과연 이게 쓸모있느냐, 어린쥐만 되면 사람은 안되느냐, 늙으면 죽어야함? 뭐 이런문제들은 나중에 천천히 생각해 보자고들..

그리고 아직 논문 나온지 한달밖에 안 되었다. 만약 실험을 하는 이분야 업자들이라면..님은 논문에 나온 새로운 프로토콜 한달안에 셋업해서 해본 경험이 얼마나 있는지부터 한번 곰곰히 생각해 보실것. 남의 실험 혹은 테크닉을 내가 재현하려면 시간이 필요하고 이 테크닉을 보다 재현성있고 적용범위가 넒은 것으로 만드는 것은 바로 줄기세포 하시는 업자님들이 하실 일. 날로먹는거넘좋아하면비브리오균이